[發(fā)明專利]蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710231693.9
• 申請日: 2017-04-11
• 公開（公告）號: CN107304226B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱順義;高斌;朱麗梅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院動物研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;A01N47/44;A01P7/04
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

本發(fā)明提供一種蝎α?型神經(jīng)毒素的突變體或其片段，所述突變體包括如SEQ ID NO：1所示的序列，并且突變位點位于所述序列的N?轉(zhuǎn)角，B環(huán)和J環(huán)三個結(jié)構(gòu)域中。本發(fā)明還提供了編碼所述突變體的DNA序列，用于轉(zhuǎn)化所述序列的宿主細胞。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的蝎α?型神經(jīng)毒素突變體，不僅消除了對老鼠的毒性，而且保留甚至增強了對昆蟲的毒性，不僅可以用于研發(fā)增效型微生物殺蟲劑，還可以用作肽類殺蟲劑，而且本發(fā)明首次使用進化生物信息學(xué)的方法指導(dǎo)開發(fā)殺蟲分子的先導(dǎo)物，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

本申請要求2016年04月22號提交的名稱為“蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體及其用途”，申請?zhí)枮?01610251397.0的發(fā)明專利申請的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽的突變體及其用途，具體涉及蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體及其在制備多肽類殺蟲劑中的用途。

背景技術(shù)

我國為農(nóng)業(yè)大國，害蟲種類繁多，嚴重威脅我國糧食和其它農(nóng)作物的產(chǎn)量。目前，我國的害蟲防治主要依賴于化學(xué)類農(nóng)藥(如有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類等)。這些農(nóng)藥的持續(xù)和大量的使用，一方面造成了害蟲耐藥性的日益增加；同時農(nóng)藥殘留對環(huán)境和人類健康造成影響。為了尋求高效低毒的害蟲防治措施，近幾年，殺蟲微生物，如白僵菌和綠僵菌正日益受到重視。與化學(xué)類農(nóng)藥相比，殺蟲微生物具有明顯的優(yōu)勢：1)物種選擇性高導(dǎo)致對人畜和自然環(huán)境安全無害；2)繁殖快，生產(chǎn)成本低；3)害蟲不易產(chǎn)生抗藥性；4)有自然傳播感染的能力，在環(huán)境中存活力強，可以長期壓低蟲口密度；5)害蟲不易產(chǎn)生抗藥性。盡管如此，微生物殺蟲劑也有兩個主要的缺點：1)殺蟲譜窄，只針對特定種類的害蟲；2)感染的潛伏期導(dǎo)致殺蟲效果慢，造成實質(zhì)性經(jīng)濟損失。

電壓門控鈉通道(Voltage-gated Na⁺channel，Na_v)廣泛分布于昆蟲和哺乳動物的肌肉、神經(jīng)元、腺體、心肌的可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其活動與細胞的興奮、收縮、分泌和突觸傳遞等特異性功能密切相關(guān)，也是重要的藥物靶點。哺乳動物基因組編碼至少9個不同亞型的電壓門控鈉通道，分別命名為Nav1.1-Nav1.9。不同亞型的鈉通道分別在不同組織中表達。以人類為例，Nav1.1，Nav1.6和Nav1.9主要在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)表達；Nav1.2和Nav1.3主要在大腦表達，Nav1.4分布于骨骼肌；Nav1.5分布于心肌；Nav1.7和Na_v1.8主要分布于背根神經(jīng)節(jié)。這些鈉通道具有相似的結(jié)構(gòu)構(gòu)架，分成4個相似的結(jié)構(gòu)域(D1-D4)，每個結(jié)構(gòu)域由6個跨膜的α-螺旋(S1-S6)組成，前四個螺旋(S1-S4)為電壓感受器區(qū)，S5-S6為孔形成區(qū)。

蝎是一類有毒動物，以昆蟲和蜘蛛等小型節(jié)肢動物為食。條斑鉗蝎(Mesobuthuseupeus)是一種小型的沙漠類蝎，主要分布在我國東北以及土耳其、伊朗、俄羅斯和蒙古等部分國家，以小型昆蟲(如蟋蟀和蟑螂)為食。毒液在蝎捕食和防御過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在大多數(shù)鉗蝎科(Buthidae)毒液中存在蝎α-型神經(jīng)毒素，是這類蝎種主要的毒性成分。

條斑鉗蝎的α-型神經(jīng)毒素為一個多基因家族，由超過14個的毒素成員組成，這類毒素組成了一個進化上保守的多肽家族，由大約60-76個氨基酸組成，含有4對二硫鍵，屬于典型的半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊構(gòu)架，靶向電壓門控鈉通道。蝎α-型神經(jīng)毒素為該家族的一個亞家族分支，其成員通過與鈉通道細胞外表面的受體位點3結(jié)合，延緩?fù)ǖ朗Щ钸^程并放大峰電流。基于毒素的藥理學(xué)特征和物種選擇性，α-型神經(jīng)毒素被分成3個功能組：1)經(jīng)典α-型神經(jīng)毒素；2)昆蟲α-型神經(jīng)毒素；3)α-like毒素。

研究表明，這類毒素能夠與獵物的電壓門控鈉通道的受體位點相互作用，修飾通道的門控特性(激活和失活)導(dǎo)致獵物軟癱和死亡。作為高親和性配體，這類毒素為研究鈉通道的結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)功能提供了最佳的分子工具，并且由于其獨特的結(jié)構(gòu)特征，長期以來它一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)家用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理想模型；另外，由于其強的殺昆蟲毒性，這類毒素也被認為是設(shè)計肽類殺蟲劑的有效模板。特別是作為殺蟲微生物的增效劑具有誘人的前景。