[發明專利]一種酪氨酸磷酸化蛋白質定量分析方法

在審

• 申請號: 201710231387.5
• 申請日: 2017-04-11
• 公開（公告）號: CN108693348A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 葉明亮;李亞楠
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/543
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種酪氨酸磷酸化蛋白質定量分析方法，其特征在于：

以經過修飾的SH2超親體為一抗，基于酶聯免疫吸附法(ELISA法)作為定量分析方法，得到待測樣品中酪氨酸磷酸化水平的動態變化曲線，檢測過程中，以酪氨酸磷酸化標準蛋白為參照樣品得到標準曲線，以標準曲線為參照，實現待測樣品中酪氨酸磷酸化水平定量分析；

具體為：以已知質量濃度的進行梯度稀釋的酪氨酸磷酸化標準蛋白作為參照樣品與梯度稀釋的待測樣品按照酶聯免疫吸附法進行定量分析，對參照樣品中不同質量濃度所含酪氨酸磷酸化蛋白質量與信號強度值建立標準曲線，所述參照樣品的標準曲線的橫坐標為參照樣品的蛋白質量，縱坐標為信號強度值；并將一同操作條件的待測樣品的動態變化曲線插入該標準曲線，所述待測樣品的動態變化曲線的縱坐標為信號強度值，根據信號強度值與參照樣品的標準曲線的縱坐標進行比對，得到待測樣品中相同信號強度值對應酪氨酸磷酸化蛋白質的質量。

2.根據權利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

通過所述定量分析方法同時定量分析多個復雜待測樣品的酪氨酸磷酸化蛋白水平。

3.根據權利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

所述SH2超親體氨基酸序列No.1為：

WYFGKITRRESERLLLNAENPRGTFLVRESETVKGAYALSVSDFDNAKGLNVKHYLIRKLDSGGFYITSRTQFNSLQQLVAYYSKHADGLCHRLTTVCPTSK。

4.根據權利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

所述SH2超親體的修飾方法可以為細菌表達、純化或生物素化修飾以獲得穩定的SH2超親體。

5.根據權利要求4所述的定量分析方法，其特征在于：

所述細菌表達、純化步驟為：

將轉染了序列N端帶有組氨酸和谷胱甘肽S轉移酶標簽的SH2超親體融合蛋白的質粒的大腸桿菌在含有5-500g/mL抗生素的LB(Luria-Broth)液體培養基中培養至OD₆₀₀為0.6-0.8后，向培養基中加入0.1-1.0mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，4-37℃，100-500轉/分鐘，搖床中震蕩過夜，之后4-37℃離心10-30分鐘收集細菌菌體，裂解液重懸，超聲提取蛋白，再次4-37℃離心10-30分鐘，并收集上清；利用組氨酸標簽首先通過鎳柱純化SH2超親體蛋白，上樣后，通過5-100mM咪唑洗滌除去細菌裂解液中的雜蛋白，200-500mM咪唑洗脫SH2超親體蛋白，凝膠排阻柱除去咪唑，進一步純化SH2超親體蛋白，測定蛋白質濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定蛋白質純度，得到細菌表達、純化后的SH2超親體蛋白；

所述生物素化修飾方法為：

取0.2-10mg/mL SH2超親體與生物素化試劑生物素-NHS以摩爾比為1:1-1:10避光震蕩反應，4-37℃反應1-24小時；

向反應體系中加入過量(SH2超親體與NH₄Cl摩爾比大于1)的NH₄Cl終止反應；反應后的溶液用10k超濾管超濾，PBS洗滌后倒置超濾管，收集液體；使用BCA法測定得到的SH2超親體與生物素交聯后的溶液(SH2-生物素)的濃度；使用HABA法測定得到的SH2-生物素溶液平均每個SH2上標記生物素個數；使用ELISA方法評價最佳比例；最后將得到的SH2-生物素溶液分裝，-20～-80℃凍存待用。

6.根據權利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

所述待測樣品和參照樣品為帶有酪氨酸磷酸化修飾的蛋白或肽段，例如phosphotyrosine-BSA、帶有酪氨酸磷酸化位點的表皮因子生長受體蛋白、細胞裂解液、組織提取蛋白、細胞酶解液、帶有酪氨酸磷酸化位點修飾的肽段。