[發(fā)明專利]一種基于Fe?Nb?Cu?B納米探針篩選厭氧菌中藥抑制劑的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710228930.6
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN107085102A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張錦勝;萬益琴;彭紅;巫小丹;鄒燈超;鄭洪立;趙茹
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 南昌洪達(dá)專利事務(wù)所36111
• 代理人: 劉凌峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種中藥配方的篩選方法。

背景技術(shù)

抗生素在殺菌同時，也會造成人體損害，影響肝、腎臟功能、胃腸道反應(yīng)等。濫用抗生素可能引起某些細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，對感染的治療會變得十分困難。目前，幾乎沒有一種抗菌藥物不存在耐藥現(xiàn)象。開發(fā)具有抗菌作用的中藥及配方具有積極意義。

許多中藥及配方藥具有抗菌消炎作用，一些中草藥的有效成分和分子結(jié)構(gòu)等也已經(jīng)全部或部分地研究清楚。例如黃連和黃柏止痢的主要成分小蘗堿（黃連素）、黃芩抗菌的主要成分黃芩素等等。大量事實證明，中國古代勞動人民通過長期實踐所積累起來的醫(yī)藥遺產(chǎn)是極為豐富、極為寶貴的。我們應(yīng)當(dāng)珍視這個祖國醫(yī)藥學(xué)的偉大寶庫，努力發(fā)掘，加以提高，從中可以開發(fā)具有抗菌消炎作用的中藥，可以取代或部分取代抗生素。

厭氧菌是一類在無氧條件下比在有氧環(huán)境中生長好的細(xì)菌，而不能在有空氣存在情況下生長的細(xì)菌。這類細(xì)菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無氧發(fā)酵的方式進(jìn)行。它能引起人體不同部位的感染，包括闌尾炎、膽囊炎、中耳炎、口腔感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、腹膜炎等多種疾病。在傳統(tǒng)的開發(fā)針對某種厭氧菌的中藥新配方過程中，一般是在滅菌的培養(yǎng)基中接種厭氧菌后加入中藥組分，在特殊的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一段時間后再取樣進(jìn)行劃線培養(yǎng)，計算菌落數(shù)，從而確定某中藥組成配方是否有抑菌作用。劃線培養(yǎng)也需要在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且培養(yǎng)周期至少要幾天，因此整個周期長，效率低。本方法是針對上述問題發(fā)明的一種中藥配方的快速篩選方法。

本方法的基本原理：單克隆抗體或抗原分子通過共價鍵結(jié)合，這種結(jié)合不會改變單克隆抗體、抗原的免疫學(xué)特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結(jié)合。而四元Fe-Nb-Cu-B材料具有鐵磁性，其元素Fe外層具有多個未成對電子，具有高飽和磁化強(qiáng)度，在粒徑小到一定程度時，會出現(xiàn)順磁和超順磁特性，F(xiàn)e-Nb-Cu-B納米材料會對周圍水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫時間的影響非常大，具有放大核磁共振馳豫信號的作用。非常微量的Fe-Nb-Cu-B納米材料就會造成水的核磁共振弛豫時間大幅下降。因此可以通過構(gòu)建Fe-Nb-Cu-B納米探針，從磁共振的角度來做檢測是否存在目標(biāo)菌，從而間接評估中藥成分的抑菌作用。

主要步驟：

1）. Fe-Nb-Cu-B納米探針制備。從市場上購買順磁Fe-Nb-Cu-B納米材料，也可以通過其他方法制備納米級的Fe-Nb-Cu-B。使用硅烷偶聯(lián)劑，其通式為:Y(CH₂)nSiX₃。此處，n為0-3；X為可水解的基團(tuán)；Y為有機(jī)官能團(tuán)。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，這些基團(tuán)水解時即生成硅醇(Si(OH)₃)，而與無機(jī)物質(zhì)結(jié)合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、環(huán)氧基、甲基丙烯酰氧基、巰基。這些反應(yīng)基團(tuán)可與有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)而結(jié)合。因此，通過使用硅烷偶聯(lián)劑，可在無機(jī)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質(zhì)懸殊的材料連接在一起提高復(fù)合材料的性能和增加粘接強(qiáng)度的作用。通過硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)可以得到表面修飾的氨基化或羧基化的Fe-Nb-Cu-B納米材料。進(jìn)一步通過偶聯(lián)抗體，可實現(xiàn)表面功能化，形成特異性免疫探針，封閉多余的活性位點，離心分離后可以將過量的抗體分離，即可以得到抗性修飾的Fe-Nb-Cu-B納米探針。

2）. 采用聚苯乙烯材料制作的樣品管進(jìn)行中藥篩選。聚苯乙烯材料與酶標(biāo)板類似，探針表面抗體會由于吸附作用而結(jié)合在聚苯乙烯材料的表面，但是，探針表面的抗體吸附到聚苯乙烯材料表面的速度與探針表面抗體結(jié)合目標(biāo)菌的速度相比，前者速度慢的多，兩者是競爭關(guān)系。因此，在聚苯乙烯樣品管中加入滅菌的厭氧菌的培養(yǎng)基，接種目標(biāo)厭氧菌后加入需要篩選的中藥提取液，密閉厭氧培養(yǎng)一段時間后，加入步驟1）所制備的Fe-Nb-Cu-B納米探針，充分混合震蕩反應(yīng)一段時間，若樣品管中有目標(biāo)菌生長，則Fe-Nb-Cu-B納米探針表面的抗體首先會與目標(biāo)菌結(jié)合，從而使得Fe-Nb-Cu-B納米探針留在液體中。若樣品管中沒有目標(biāo)菌，則Fe-Nb-Cu-B納米探針表面的抗體會逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面，從而使液體中沒有Fe-Nb-Cu-B納米探針。前已述及，微量的Fe-Nb-Cu-B納米材料就會造成水的核磁共振弛豫時間大幅下降。以無菌的沒有接種目標(biāo)菌的培養(yǎng)基液體為空白，測得的懸濁液的弛豫時間相比有顯著降低，則說明液體中含有探針，從而間接證明樣品中有目標(biāo)菌，探針的量與弛豫時間的下降值呈正比，通過加標(biāo)定量探針可以間接定量出目標(biāo)菌的量。有目標(biāo)菌存在，則說明中藥抑菌作用不明顯，反之則說明有抑菌作用。