[發(fā)明專利]快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710228673.6
• 申請(qǐng)日: 2017-04-10
• 公開（公告）號(hào): CN106834279B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃澤瑜;趙楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都圖徑生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫;高蕓

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法。針對(duì)現(xiàn)有提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法耗時(shí)長(zhǎng)等問題，本發(fā)明提供一種快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法，步驟如下：a、將冬蟲夏草菌菌種接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10～20d后，過濾，收集菌絲沉淀；b、取菌絲沉淀0.5～1g,加入蒸餾水2～10ml，分散器打碎菌體，離心后棄上清；加入磷酸氫二鉀溶液，離心棄上清；再加入磷酸氫二鉀震蕩成均勻懸浮的菌液，加入混合酶液,震蕩混勻、煮沸，再于冰上放置5～30min,離心，即得。本發(fā)明方法專用于冬蟲夏草菌，在提取時(shí)可排除其他雜菌的干擾，DNA純度高；并且，本發(fā)明耗時(shí)短，現(xiàn)有的CTAB法耗時(shí)4?6h，本發(fā)明耗時(shí)僅為1.5h左右。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法。

背景技術(shù)

冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis是我國(guó)一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，是一種昆蟲與真菌的結(jié)合體。是我國(guó)一種傳統(tǒng)的珍貴中藥材。野生冬蟲夏草僅分布于青藏高原及周邊地區(qū)海拔 3000m以上、雪線以下的地區(qū)，在我國(guó)的分布包括西藏、青海、四川、云南、甘肅5省區(qū)的高寒草甸草原。《中華人民共和國(guó)藥典》自1963年版直到目前的2015年版都對(duì)冬蟲夏草進(jìn)行了收錄，2015年版藥典記載其“甘，平。歸肺、腎經(jīng)。補(bǔ)腎益肺，止血化痰。用于腎虛精虧，陽痿遺精，腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血”。

迄今為止，有關(guān)冬蟲夏草菌的研究越來越側(cè)重于人工培育的方法，借助于分子生物學(xué)手段的實(shí)驗(yàn)也越來越多。在研究其交配型基因的表達(dá)或產(chǎn)物時(shí)首先需要獲得冬蟲夏草菌的基因組DNA，才能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

現(xiàn)有技術(shù)提取冬蟲夏草菌的基因組DNA的方法主要為CTAB法，該方法提取的DNA可用于基因擴(kuò)增、全基因組測(cè)序或其他對(duì)基因組DNA要求較高的分子生物學(xué)試驗(yàn)中。但CTAB法耗時(shí)長(zhǎng)，需要的儀器設(shè)備多，設(shè)備要求高，提取成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為：現(xiàn)有提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備要求高、生產(chǎn)成本高等問題。

本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案為：提供一種快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法。該方法包括以下步驟：

a、冬蟲夏草菌菌體培養(yǎng)與收集

將冬蟲夏草菌菌種接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10～20d后，過濾，收集菌絲沉淀；

b、冬蟲夏草菌基因組DNA的提取

取步驟a所得菌絲沉淀，加入蒸餾水，打碎菌體，離心后棄上清；加入磷酸氫二鉀溶液，離心棄上清；再加入磷酸氫二鉀震蕩成均勻懸浮的菌液，加入混合酶液,混合酶液為蝸牛酶和纖維素酶的混合液,震蕩混勻0.5～3h，煮沸5～30min，再于冰上放置5～30min，離心，上清即為冬蟲夏草菌基因組DNA。

其中，上述快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法中，步驟a中所述的培養(yǎng)基組成為：每升培養(yǎng)基中含馬鈴薯80～300g，葡萄糖20～50g，蛋白胨5～20g,酵母提取物1～10g,磷酸氫二鉀0.1～5g，硫酸鎂0.1～5g，余量為水。

其中，上述快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法中，步驟a中所述培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為 10～25℃，培養(yǎng)時(shí)置于轉(zhuǎn)速為100～250r/min震蕩搖床中進(jìn)行。

其中，上述快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述的離心是指在6000～ 10000r/min離心5～10min。

其中，上述快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述蒸餾水加入量為每 0.5～1g菌絲沉淀中加入蒸餾水2～10ml。

其中，上述快速提取冬蟲夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述的磷酸氫二鉀溶液濃度為0.01～0.1mol/L，加入量為每0.5～1g菌絲沉淀中加入2～10ml。