[發明專利]一種基于固相連接CRISPR/Cas9gRNA串聯表達載體構建新技術

在審

• 申請號: 201710228205.9
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN107058385A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 楊興林;陳國澤;潘謳東
• 申請（專利權）人: 和元生物技術（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于固相連接CRISPR/Cas9gRNA串聯表達載體構建新技術, 其特征在于：使用鏈霉親和素磁珠和biotin偶聯的PCR起始片段、延伸片段和終止片段，通過精確設計的酶切位點，使每個片段能通過粘末端精確連接；經過酶切，清洗，連接的步驟的循環而將多個片段在短時間內高效連接多個gRNA表達載體構建技術。

2.根據權利要求1所述方法中使用的spCas9及saCas9模板序列：其特征在于：由gRNA-spacer-U6 promoter模塊組成的模板序列，其中，spCas9對應的模板含有SEQ. NO.1所示的堿基序列，saCas9對應的模板含有SEQ. NO.2所示的堿基序列。

3.如權利要求1所述方法中使用PCR引物序列：其特征在于：所述引物序列為含有SEQ. NO.3及SEQ. NO.4所示的堿基序列；SEQ. NO.3及SEQ. NO.4用于PCR獲得初始片段。

4.如權利要求1所述方法中使用PCR引物序列：其特征在于：所述引物序列為含有SEQ. NO.5、SEQ. NO.6和SEQ. NO.7所示的堿基序列；其中SEQ. NO.5或SEQ. NO.6引物可以根據要引入gRNA的數量設計多條；SEQ. NO.7配合根據SEQ. NO.5或SEQ. NO.6設計引物用于PCR獲得延伸片段。

5.如權利要求1所述方法中使用PCR引物序列：其特征在于：所述引物序列為含有SEQ. NO.8所示的堿基序列；SEQ. NO.8配合根據SEQ. NO.5或SEQ. NO.6設計引物用于PCR獲得終止片段。

6.根據權利要求1所述方法及2,3,4,5所述引物的多gRNA表達載體在細胞及動物模型等基因組編輯技術中的應用。