[發明專利]一種軟X射線冷凍成像樣品的制備方法

有效

• 申請號: 201710228198.2
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN107192598B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 劉剛;郭亮;熊瑛;侯雙月;田揚超
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: G01N1/36
• 分類號: G01N1/36;G01N1/42
• 代理公司: 北京科迪生專利代理有限責任公司 11251
• 代理人: 楊學明;顧煒

本發明涉及一種軟X射線冷凍成像樣品的制備方法，步驟如下：(1)在基片上沉積低表面能材料層；(2)根據細胞樣品的特征以及軟X射線冷凍成像設備的樣品座進行掩模設計；(3)在沉積有低表面能材料的基片上制作細胞樣品模具結構；(4)將需要與軟X射線冷凍成像設備樣品座相連接的部件放入細胞樣品模具結構中，滴加細胞樣品水溶液，并快速浸入到低溫液體中進行冷凍；(5)冷凍后形成的無定形冰與細胞樣品模具發生分離，獲得自支撐冷凍細胞樣品。利用本發明制備的自支撐冷凍細胞樣品進行軟X射線冷凍成像，可以滿足完整角度X射線成像且減少光子能量損耗，能有效地提高軟X射線冷凍成像能力。

技術領域

本發明涉及一種軟X射線冷凍成像樣品的制備方法，屬于冷凍細胞樣品顯微成像技 術領域。

背景技術

軟X射線冷凍成像是一種研究細胞自然狀態下超微結構的重要方法，可以為細胞生 物學提供重要的信息。在波長為2.34-4.37nm的水窗區域，富含碳和氮的生物成分對X射線的吸收強度比水大一個數量級，因此樣品無需脫水和染色即可得到高襯度成像。此外，不同生物結構中，各種元素的含量比例不同，因此吸收襯度也不同，重構后獲得的 不同結構的線性吸收系數分布就會不一樣。根據該性質可區分樣品中的不同結構，如細 胞中的核糖體、液泡、線粒體等(Uchida M.,Yeast.28,2011:227-236)，它提供了高信噪 比、分辨率為幾十納米的吸收襯度成像。通過X射線斷層掃描技術(CT成像)能夠獲 得更加豐富的結構信息，實現細胞的三維成像。

冷凍細胞樣品的制備是軟X射線冷凍成像的重要環節，良好的制樣是獲得高質量成 像的必要前提。現有的軟X射線冷凍成像樣品制備大多采用電鏡用銅網，制樣過程相對簡單。但是，當樣品旋轉到高角度時使用的銅網會限制樣品信息的采集，造成樣品信息 的角度缺失。由于角度受限，三維圖像重構效果往往不理想，重構的樣品結構形態和線 性吸收系數都有偏差，在角度缺失的方向會形成楔形偽跡，這給樣品數據的后期定量計 算和分析帶來困難(Z.Liang.,Synchrotron Rad.23,2016:606-616)。為了解決角度缺失問題， 出現了基于毛細管的樣品制備方法。薄壁玻璃毛細管可以實現完整角度的數據收集，因 此消除了使用銅網所造成的角度缺失問題，可以給出較好的三維重構結果。但是，這種 制樣方法又會帶來其他問題。毛細管細胞樣品由石英玻璃管制做，管壁約幾百納米，而 軟X射線水窗波段內石英的吸收系數比較大，毛細管會吸收超過一半的光子，這大大降 低了光子的利用率和成像襯度，增長了曝光時間，給提高軟X射線冷凍成像的分辨率帶 來了困難。為了進一步克服毛細管對于成像的限制，有人采用碳納米管進行制樣，在冷 凍電鏡成像上取得了一定的效果。但在軟X射線冷凍成像中，碳納米管的引入會對生物 成像造成極大干擾(Colin M.Palmer,Ultramicroscopy,137,2014:20-29)。因此，對于軟X 射線冷凍成像樣品的制備，始終沒有較好的方法。

發明內容

本發明的目的是針對現有的軟X射線冷凍樣品制備方法中的成像角度缺失以及能量損失問題，提出一種軟X射線冷凍成像樣品的制備方法，通過制作自支撐結構的冷凍 樣品來解決上述問題，可以滿足完整角度X射線成像且減少光子能量損耗，有效地提高 軟X射線冷凍成像能力。

本發明要實現的自支撐冷凍細胞樣品如圖1所示。圖1中包括細胞樣品模具和在快速冷凍后從細胞樣品模具中脫離形成的自支撐冷凍細胞樣品。其中，1為細胞樣品模具： 灰色邊框的用途為將細胞樣品限制在所設計的結構中，中間凹陷的區域為細胞樣品的填 充區域。自支撐冷凍細胞樣品分為兩部分：凸字形的成冰區和連接機構。成冰區為低溫 速凍后形成的以冰為主體的脫離細胞樣品模具的部分，分為細小頂部的成像區(2)和 底部的連接區(3)。其中，頂部的微米尺寸部位為進行軟X射線冷凍成像的細胞樣品 區，底部尺寸較大的區域為實現自支撐冰結構與外界連接的連接區。連接機構(4)的 功能是為了將成冰區連接到軟X射線冷凍成像設備的樣品座上。

獲得自支撐冷凍細胞樣品的關鍵是：細胞樣品在經低溫快速冷凍后如何從基片上脫 離，形成自支撐結構。通常，水在物體表面凍結成冰并連成一體的過程可以分為兩步：