[發(fā)明專(zhuān)利]一種鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體、合成方法及DNA快速偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710223455.3
• 申請(qǐng)日: 2017-04-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107098934B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊朝勇;馬艷麗;黃迪;劉文麗;毛瑜;朱志
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廈門(mén)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07F9/655
• 分類(lèi)號(hào): C07F9/655;C07K1/113
• 代理公司: 廈門(mén)市首創(chuàng)君合專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學(xué)明

1.鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體，分子式為C₂₈H₄₆N₃O₆P，其結(jié)構(gòu)式如下：

2.如權(quán)利要求1所述的鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體的用途，用于DNA與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。

3.如權(quán)利要求1所述的鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體的合成方法，包括以下步驟：

1)1)將鄰苯二醛羧酸衍生物OPA-COOH、6-氨基-1-己醇、二環(huán)己基碳二亞胺、1-羥基苯并三氮唑按照摩爾比1：1.5-2.5：1-2：1-2混合，抽排除去空氣，加入溶劑四氫呋喃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為12～24h；而后過(guò)濾除去沉淀，再分離純化，得到鄰苯二醛羥基衍生物OPA-OH；其中，OPA-COOH及OPA-OH結(jié)構(gòu)式分別如下：

2)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將OPA-OH和N，N-二異丙基乙胺混合，用二氯甲烷溶解，再加入2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，攪拌反應(yīng)后用硅膠柱層析分離純化，得到鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體，其中，所述OPA-OH、2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺、N，N-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1-2:2-5。

4.如權(quán)利要求3所述一種鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體的合成方法，其特征在于步驟1)，加入的溶劑的體積為溶質(zhì)的1-20倍。

5.如權(quán)利要求3所述一種鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體的合成方法，其特征在于步驟2)，所述反應(yīng)溫度為20-30℃，反應(yīng)時(shí)間為1-5h。

6.DNA快速偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：

1)合成權(quán)利要求1所述的鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體；

2)在DNA的5’端修飾鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體；

3)在緩沖液的條件下，將5’端修飾鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體的DNA和蛋白質(zhì)室溫孵育0.5-3小時(shí)。

7.如權(quán)利要求6所述DNA快速偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法，其特征在于緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液。

8.如權(quán)利要求6所述的DNA快速偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法，其特征在于：

步驟2)包括以下步驟：

1)CPG作為固相載體，以正常的DNA單體堿基作為原料，在DNA合成儀上由3’端到5’端合成DNA序列，然后在DNA的5’端修飾鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體；

2)加入甲胺/氨水，65℃條件下孵育30min將OPA-DNA產(chǎn)物從CPG上切割下來(lái)；

3)利用反相色譜進(jìn)行分離純化，所用流動(dòng)相為0.1M醋酸三乙胺和乙腈；

4)利用20％三氟乙酸/二氯甲烷(v/v)，脫去醛基保護(hù)，而后抽干去除。

9.如權(quán)利要求8所述鄰苯二醛衍生物亞磷酰胺單體修飾合成OPA-DNA，其特征在于步驟4)，所述20％三氟乙酸/二氯甲烷(v/v)脫去醛基保護(hù)之前，先用脫鹽柱脫鹽純化。