[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)大鼠鼠源性成分的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710221364.6
• 申請(qǐng)日: 2017-04-06
• 公開（公告）號(hào): CN107012219B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王學(xué)政;魯艷芹;劉志勝;季福玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島元信檢測(cè)技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)大鼠鼠源性成分的方法，步驟如下：(1)取待檢測(cè)樣品，提取DNA；(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；(3)當(dāng)測(cè)得的Cp平均值為小于35時(shí)，曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，呈現(xiàn)陽性，則待檢測(cè)樣品中含有大鼠鼠源性成分。本發(fā)明所述方法采用具有良好的特異性和重復(fù)性的引物和探針，利用所述的引物和探針進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠鼠源性成分，操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、特異性高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰可見、易于判定，為快速檢測(cè)大鼠鼠源性成分提供了新的途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)大鼠鼠源性成分的方法，特別涉及利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法檢測(cè)大鼠鼠源性成分的方法，屬于動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著人民群眾生活水平的日益提高，牛羊肉的消費(fèi)量逐年增加。因牛羊肉價(jià)格高、加工企業(yè)小散亂多難以監(jiān)管，掛羊頭賣狗肉的現(xiàn)象屢禁不止，老鼠肉冒充價(jià)格昂貴的牛羊肉的事件偶有發(fā)生，老鼠肉直接冒充牛羊肉或摻雜在牛羊肉制品中流入老百姓的餐桌，造成了及其惡劣的社會(huì)影響，其對(duì)食用者造成巨大的人身傷害。老鼠由于自身攜帶多種病菌，是多種傳染病病原的儲(chǔ)存宿主和主要傳染源，同時(shí)，老鼠肉所含的鉛和砷等有毒有害物質(zhì)的含量也遠(yuǎn)高于其他肉類，直接食用會(huì)給人們帶來極大的身體危害和疫病傳染風(fēng)險(xiǎn)，輕則中毒，重則死亡。但目前，尚沒有大鼠鼠源性成分檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，普通消費(fèi)者乃至食藥質(zhì)監(jiān)部門通過肉眼難以鑒別，而傳統(tǒng)檢測(cè)方法繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)也導(dǎo)致其檢測(cè)存在極大難度。

熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí)，探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于物種鑒別領(lǐng)域。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN105648046A(申請(qǐng)?zhí)?01410644049.0)公開了利用動(dòng)物種屬間特異性較強(qiáng)的線粒體DNA序列設(shè)計(jì)5種動(dòng)物(綿羊、山羊、水貂、海貍鼠和鴨)種屬特異性引物，通過PCR反應(yīng)得到長(zhǎng)度各不相同的特異性擴(kuò)增片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，能夠一次性、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)單快捷的鑒別綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉，以及混合或加工過的肉制品中的這五種肉的成分。該技術(shù)雖然可以區(qū)分上述五種動(dòng)物，但由于引物的特異性，其無法區(qū)分大鼠鼠源性成分，特別是與大鼠遺傳關(guān)系較近的諸如小鼠等來源的成分。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測(cè)大鼠鼠源性成分的方法，為大鼠鼠源性成分的檢測(cè)提供技術(shù)支持，為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的建立提供實(shí)驗(yàn)支撐，為打擊肉類摻假行政執(zhí)法提供有力的科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種用于檢測(cè)大鼠鼠源性成分的方法，步驟如下：

(1)取待檢測(cè)樣品，提取DNA；

(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物組由一對(duì)特異性引物和特異性探針組成，上游特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)當(dāng)測(cè)得的Cp平均值為小于35時(shí)，曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，呈現(xiàn)陽性，則待檢測(cè)樣品中含有大鼠鼠源性成分。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，DNA的濃度為360ng/μL，純度為1.90。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，提取DNA為利用深加工食品DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。深加工食品DNA提取試劑盒為本領(lǐng)域常規(guī)市售產(chǎn)品，如天根生化科技有限公司等均有銷售。