[發明專利]用于檢測產氣腸桿菌的LAMP引物組、試劑盒及快速檢測方法

有效

• 申請號: 201710220611.0
• 申請日: 2017-04-06
• 公開（公告）號: CN107012218B
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 芮勇宇;楊秋;李思
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學南方醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.用于檢測產氣腸桿菌的LAMP引物組，所述LAMP引物組包括一對外引物、一對內引物和一對環引物，其核苷酸序列分別如下所示：

ThdF-F3:5’-GCGATCGTCACCGATATC-3’；

ThdF-B3:5’-GGTAATCGGCAGCTTAGC-3’；

ThdF-FIP:5’-CCACTTCATCACTGGCGTCAATTCACATCGACGGTATGC-3’；

ThdF-BIP:5’-GCGAATCGGCATTGAACGCGCCGTCGACCATAAACAG-3’；

ThdF-LF:5’-GCCTGCGGTATCGATGATAT-3’；

ThdF-LB:5’-ATTGAACAGGCGGATCGG-3’。

2.用于檢測產氣腸桿菌的試劑盒，包括權利要求1所示的LAMP引物組、DNA聚合酶、反應液、顯色劑、熒光染料、封閉液、陽性對照和陰性對照；

其中，所述外引物、內引物、環引物的摩爾比為：(1～2)：(4～8)：(2～4)。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：反應液為含有20mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、8mM硫酸鎂、0.1%曲拉通X-100、甜菜堿0.8mM、4種dNTPs均2.8mM。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：熒光染料為SYBR GREEN Ⅰ。

5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：顯色劑為鈣黃綠素與錳離子配合物，所述鈣黃綠素與錳離子配合物的混合體積比為1：10～15。

6.非疾病診斷目的的產氣腸桿菌的快速檢測方法，包括如下步驟：

（1）提取待檢樣品DNA；

（2）利用權利要求1的LAMP引物組對待檢樣品DNA進行恒溫熒光擴增或恒溫擴增；

所述恒溫熒光擴增反應在qPCR儀器中進行，實時讀取熒光信號；若有“S”型擴增曲線，則判斷為陽性，若無“S”型擴增曲線，則判斷為陰性；

所述恒溫擴增反應在恒溫裝置下進行，反應結束后加入1～2μL的顯色劑，混勻后即可觀察反應液的顏色：若呈現熒光黃綠色，則判斷為陽性，若呈現橙色，則判斷為陰性；

所述恒溫熒光擴增反應的25μL反應體系含有：ThdF-F3 0.02μM、ThdF-B3 0.02μM、ThdF-FIP 0.16μM、ThdF-BIP 0.16μM、ThdF-LF 0.08μM、ThdF-LB 0.08μM、反應液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待檢樣品DNA 2μL、熒光染料0.5μL，用超純水補齊到25μL；反應體系混勻后，加入20μL密封液；恒溫熒光擴增反應的條件為60～65℃反應55～65min。

7.根據權利要求6所述的非疾病診斷目的的產氣腸桿菌的快速檢測方法，其特征在于：所述恒溫擴增反應的25μL反應體系含有：ThdF-F3 0.02μM、ThdF-B3 0.02μM、ThdF-FIP0.16μM、ThdF-BIP 0 .16μM、ThdF-LF 0.08μM、ThdF-LB 0.08μM、反應液12.5μL、DNA聚合酶2μL、待檢樣品DNA 2μL，用超純水補齊到25μL；反應體系混勻后，加入20μL密封液；恒溫熒光擴增反應的條件為60～65℃反應55～65min。