[發明專利]一種用于高通量測序的無宿主背景干擾的豇豆內生真菌ITS基因擴增方法

在審

• 申請號: 201710217801.7
• 申請日: 2017-04-05
• 公開（公告）號: CN107058535A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 陳玲;孫梓健;付紹洪;盧躍華;楊建;李蘭;羅小波;潘少坤;向娟
• 申請（專利權）人: 成都市農林科學院;成都隆納生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司11340
• 代理人: 楊春

1.一種用于高通量測序的無宿主背景干擾的豇豆內生真菌ITS基因擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)植物預處理：取豇豆根新鮮樣本0.5-1g經超聲清洗后在超凈臺中使用有效氯濃度5％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒1分鐘，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為70％-75％的乙醇溶液浸泡30秒，隨后使用無菌水沖洗3-5遍徹底去除樣本表面消毒劑；

2)植物樣本總DNA提取：通過表面消毒的樣本經液氮研磨均勻后轉至1.5ml離心管，隨后通過CTAB法純化樣本總DNA；

3)樣本ITS基因的擴增：

3.1)ITS基因全長的乳液PCR擴增：該步驟采用的技術方案是：

a.設計2對引物NSNL和ITS3/ITS4均以真菌和豇豆ITS基因為模板，其中NSNL引物紅色標記堿基為鎖核酸修飾基團，用于抑制豇豆基因組來源的污染，ITS3/ITS4引物對用于豇豆ITS基因的擴增；

b.配置豇豆內生真菌ITS基因的乳液PCR混合液，該混合液為乳液發生劑和PCR擴增緩沖液一；

c.將步驟b用于擴增豇豆內生真菌ITS基因的乳液PCR混合液移入0.2ml PCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運行以下反應循環：95℃1min，1個循環；98℃5s，68-70℃1min，52℃30s，68℃1min，25個循環；68℃5min，1個循環；25℃恒溫；

d.向步驟c每個PCR管的反應產物中添加10％體積的2-丁醇，震蕩混勻后以13200×g離心5分鐘，離心完成后取下層水相溶液為模板進行ITS基因高變區/保守區擴增子擴增；

3.2)ITS基因高變區/保守區擴增子擴增：該步驟以3.1)中d步驟水相反應產物為模，使用ITS3L/ITS4L引物在PCR擴增緩沖液二中，在95℃1min，1個循環；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20個循環；68-72℃5min，1個循環；25℃恒溫的PCR循環條件下完成；

4)基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析：

4.1)豇豆內生真菌ITS基因擴增子純化回收

將3.2)步驟的反應產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒切膠回收片段大小在250-450bp左右的目標條帶，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段；使用2％瓊脂糖電泳檢測，檢測條件5V/cm，20min；

4.2)擴增子測序文庫構建

文庫構建使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit；

4.3)Illumina HiSeq測序

測序平臺為Illumina HiSeq 2500，測序模式為V2SBS快速250PE模式；

4.4)測序數據生物信息學分析

測序得到的PE reads首先使用FLASH軟件進行拼接，同時對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列等操作過程后完成數據過濾，得到可供后續分析的高質量目標序列，后續生物信息學操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，統計和作圖主要使用R完成，主要操作步驟如下：

a.根據Barcode區分樣品；

b.使用Uchime去除嵌合體；

c.在97％的相似性水平上使用UPARSE算法進行OTU聚類；

d.挑選出OTU的代表性序列；

e.使用UNITE數據庫進行物種分類信息的劃分。

2.根據權利要求1所述的用于高通量測序的無宿主背景干擾的豇豆內生真菌ITS基因擴增方法，其特征在于，所述乳液發生劑由含有4.5％Span 80，0.4％吐溫80和0.05％Tr iton X-100的礦物油構成。

3.根據權利要求1所述的用于高通量測序的無宿主背景干擾的豇豆內生真菌ITS基因擴增方法，其特征在于，所述PCR擴增緩沖液一由由40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mM MgCl2，5％甘油，1％吐溫20，1mM dNTPs，1個單位的KOD DNA聚合酶、10μM NSNL-F、10μM NSNL-R和50ng的樣本總DNA構成。