[發明專利]基于位點特異性重組的四膜蟲表達載體及其構建和應用

有效

• 申請號: 201710217711.8
• 申請日: 2017-04-05
• 公開（公告）號: CN107012146B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發明（設計）人: 許靜;王偉;薄濤;楊煥
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 14105 山西五維專利事務所(有限公司)
• 代理人: 張福增

本發明公布了一種基于位點特異性重組的四膜蟲表達載體及其構建和應用。該載體以質粒pNeo4為骨架，組合串聯的HA標簽序列、限制性內切酶酶切位點及四膜蟲ACTIN1基因的轉錄終止序列為模塊，將模塊合成、酶切位點消化插入到pNeo4的5'端多克隆酶切位點中，構建出表達載體pNeo4?3HA。使用該載體時，分別擴增獲得重組同源臂—目的基因編碼區C端序列及其3'側翼序列，經酶切連接克隆到pNeo4?3HA載體的5'上游和3'下游多克隆酶切位點中。得到的構建體經轉化四膜蟲、抗性篩選獲得表達突變細胞株。本載體實現了在自身啟動子調控下C端表達融合標簽的內源基因的目的，操作簡單快捷，3個HA標簽提高了免疫熒光定位靈敏度，還可用于蛋白親和純化和蛋白相互作用研究。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種含串聯的3個HA標簽的位點特異性重組表達載體pNeo4-3HA及其構建方法和應用。

背景技術

目的蛋白融合標簽的表達載體廣泛地應用于蛋白定位、相互作用和功能研究中。在模式生物—纖毛類嗜熱四膜蟲中，融合標簽可以通過同源重組的方式有效地重組到內源基因位點上，所以融合標簽的蛋白表達載體在四膜蟲中是一種極其有用的分子工具(Cassidy-Hanley et al,1997)。但目前能使用的該類構建載體還很少?，F在已有的目的基因融合標簽的構建體的構建方式可分為兩種：一種方法是構建內源基因啟動子調控下的目的基因融合標簽的表達構建體。該方法可以在目的基因自身啟動子調控下將目的基因融合標簽一起表達出來，可以得到內源基因在細胞中的真實定位模式。但目前獲得該類構建體的方法或者是通過使用多次重疊PCR和巢式PCR的方法得到構建體(Xu et al,2012)，或者是使用重疊PCR與多個載體的酶切、連接的方法獲得構建體(Kataoka et al,2010)。這些方法在構建重組質粒時過程復雜，往往需要使用多對引物和較長的重疊PCR引物，導致經濟成本上升并因此無法增加較多的標簽數目，從而可能由于許多目的基因在自身啟動子調控下表達的水平不高而標簽數目又少，使其抗體親和量較少，最終導致無法獲得清晰的定位信號；另一種方法是構建目的基因的過表達構建體，該構建體可使目的基因在金屬離子Cd²⁺誘導下，在MTT1的啟動子調控下過量表達，從而借以觀察目的基因在四膜蟲細胞中的定位模式(Shang et al,2002；Zweifel et al,2009)，該構建方法簡單，易于操作，通過過量表達目的基因能將表達量低的目的基因的定位信號的清晰度提高，發現定位細節，但也可能由于基因的過量表達而造成細胞發育受阻或出現非特異性定位。

為實現既能簡便經濟地獲得在目的基因自身啟動子調控下的內源基因融合標簽表達構建體，又能將標簽序列增加以提高目的基因的定位信號清晰度，本發明構建了一種基于特異性位點重組的目的基因C端含3HA標簽的內源基因表達載體，pNeo4-3HA。該載體是利用敲除載體pNeo4為構建骨架(Mochizuki,2008)，在其5'端的多克隆酶切位點的Sac1和Pst1之間將模塊(3HA-motif)插入其中構建而成。動力蛋白基因ACTIN1的3'-UTR及轉錄終止子為融合3HA標簽的目的基因的轉錄提供終止信號。該表達載體可用于目的蛋白的細胞定位、純化和蛋白相互作用分析。

發明內容

本發明的目的在于提供一種含串聯的3個HA標簽的基于位點特異性重組的表達載體pNeo4-3HA及其構建方法；以及該表達載體pNeo4-3HA在基因自身啟動子調控下的表達、定位、蛋白純化和蛋白相互作用分析中的應用。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種3HA-motif，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1。

一種表達載體pNeo4-3HA，含有如權利要求1所述的3HA-motif。

一種表達載體pNeo4-3HA的構建方法，包括以下步驟：