[發明專利]一種基于快速克隆技術的環狀RNA表達載體構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201710215532.0
• 申請日: 2017-04-04
• 公開（公告）號: CN107058360B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 楊展
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學第二醫院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 河北東尚律師事務所 13124
• 代理人: 李國聰

環狀RNA在體內外過表達時不容易形成環狀結構，目前多數過表達環狀RNA方法中只有10%左右的形成率，即使改良的方法中提高了表達量，但會將原本不屬于環狀RNA的序列加入環狀RNA中。本發明是一種基于一步法快速克隆的、人工改造的、可以完整高效地表達環狀RNA載體的構建方法及應用。利用特殊的環狀RNA過表達序列框架，上下游特異性序列，酶切位點，以及利用一步法（快速克隆法）插入環狀RNA序列的方法，達到高效、完整、便利地克隆及過表達環狀RNA。該方法及載體可以廣泛應用于各種環狀RNA的表達，為研究環狀RNA的作用機制提供便利條件，為應用環狀RNA作為體內基因靶向治療、藥物篩選提供基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物學研究領域，所涉及的應用范圍包括體內外過表達環狀RNA分子的基礎研究和用于體內過表達環狀RNA基因靶向治療的應用研究領域。具體定義為一種完整高效地過表達環狀RNA序列的載體構建方法，序列結構及其應用。

背景技術

環狀RNA( circular RNA，circRNA)是新近確認的一類特殊的非編碼RNA( non-coding RNA，ncRNA)分子，通常由部分外顯子或內含子環化而成的RNA 分子，因而其結構比普通線狀RNA穩定。circRNA普遍存在于真核細胞，具有一定的組織、時序和疾病特異性。circRNA是RNA 家族的一顆極具發展潛力的正在升起的新星，也是RNA 領域最新的研究熱點。早期，關于circRNA 的文獻報道少，且表達水平相對低，故在很長一段時間里，circRNA被認為是錯誤可變剪接( alternative splicing ) 而形成的副產品，屬于自然界中一種極罕見現象，甚至被當做遺傳意外或實驗人為因素所致，并未引起學術界重視。隨著RNA 測序和生物信息學等技術的快速發展，人們在大規模研究轉錄組數據時發現，circRNA并不像之前所認為的那樣是一種極罕見現象，反而大量存在于真核細胞中。Danan 等發現，circRNA 在古生菌細胞普遍存在，并認為其極有可能具有生物學功能。同時，Salzman 等也證實circRNA 在人類細胞基因表達中是一個普遍現象，并可能扮演著多種生物學功能的重要角色。Jeck等采用高通量測序方法，在人成纖維細胞中檢測到超過25000 種circRNA，認為circRNA 是RNA 剪切后所形成的一類極穩定的保守性產物，此外還發現circRNA可被小型干擾RNA( small interfering RNA， siRNA) 降解。Memczak 等研究證實circRNA 參與轉錄后調控，Hansen 等的研究則揭示circRNA 可作為miRNA 海綿( miRNA sponge) 來影響基因的調控與表達。盡管circRNA 被發現已有30 余年，但由于技術限制等原因，circRNA一直處于被學術界忽視的地位。但隨著近年有關circRNA 的幾項突破性研究的發現，尤其是國際著名權威刊物Nature 發表兩篇有關circRNA生物學功能的論文，震驚學術界，從此拉開揭開circRNA 神秘面紗的序幕，circRNA 已引起國內外學術界的關注，并將掀起研究熱潮。而Glazar 等建立了circRNA 專用數據庫“circBase”，該數據庫對目前已發表的circRNA 資料進行整合統一，同時提供已知的及新的circRNA 測序資料，旨在為circRNA的研究提供一個較好的交流平臺。