[發明專利]抗稻瘟病基因Pigm的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201710212270.2
• 申請日: 2017-04-01
• 公開（公告）號: CN106929585B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 金名捺;丘式浚;鄧漢超;唐曉艷;鄧興旺
• 申請（專利權）人: 深圳興旺生物種業有限公司;深圳市作物分子設計育種研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
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技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種稻瘟病抗性基因Pigm的特異分子標記的高分辨率熔解曲線分析(High-Resolution Melting Curve Analysis,HRM)稻瘟病抗性基因Pigm的特異分子標記，以及利用所述引物檢測稻瘟病抗性基因Pigm的方法。

背景技術

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，超過一半的世界人口以稻米為主食，我國超過60％的人口以稻米為主食。由子囊菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病是廣泛發生在世界各稻區影響水稻生產的重要病害之一，每年都會造成嚴重的糧食損失。實踐證明，選育和種植廣抗病品種是防治水稻病害最經濟有效的方法。近年來，水稻抗稻瘟病基因的克隆取得了重要進展，稻瘟病抗性基因的分子標記的開發對于培育抗稻瘟病水稻品種具有重要意義。

到目前為止，至少有9個稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi26,Pi50,Pi2-2)己經被定位在水稻第6染色體短臂端的Pi2/9基因簇內，這些基因都被認為是稻瘟病廣譜抗性基因，在稻瘟病抗性育種方面具有重要的應用價值(Jiang et al.,2012)。其中，水稻稻瘟病主效顯性基因Pigm為廣譜抗性基因，其抗譜明顯強于廣譜抗性基因Pi2、Pi9等，在抗病育種中具有更高的應用價值。Pigm來自秈稻谷梅4號，對收集自中國、法國和泰國的30個強致病菌株中的29個表現高抗或免疫，定位于水稻第染色體上標記C5483和C0428之間的70-kb區間內，與標記PC22705、C24901、S29742共分離，與Pi2、Pi9緊密連鎖或等位，在該區間中，通過日本晴的序列進行預測，發現有6個NBS-LRR結構域的基因，但Pigm具體是哪個基因還沒有功能確認(Deng et al.,2006；Jia et al.,2008；Deng et al.,2009)。

由于Pigm基因還沒有克隆，無法知道其詳細的DNA序列，就不能針對其功能變異設計特異性的引物來檢測其存在與否。為了檢測Pigm基因，何祖華等和許一文等分別開發了顯性分子標記M80362和M20265。但是這兩個標記對Pigm基因的檢測結果是根據目的條帶的有無來判斷的，這樣的標記穩定性不好，實驗結果重復性不強，在大規模分子輔助選擇育種中存在著很大的局限性。周亮等設計了4對Indel引物S29742、S2997、S1408、S2723，共同能夠將谷梅4號和其它95個親本材料全部分開。同時，這4對引物對谷梅4號雜交后代的分離群體的分子檢測檢測結果和田間抗性鑒定的結果完全一致，使MAS的效率達到100％，表明這些標記與Pigm共分離，完全能夠滿足大規模分子標記輔助育種的要求。但是，對基因的共分離跟蹤在基因沒有克隆的條件下，一般只需要在基因的兩端各設計一對引物即可滿足要求，而周亮等對Pigm的跟蹤選擇卻需要4對引物的共同檢測才能實現這一目的。因此，有必要重新在Pigm的兩端各開發一對新的共分離引物來對Pigm基因進行分子輔助選擇。

高分辨率熔解曲線分析技術(High Resolution Melting，HRM)是近幾年興起的由猶他大學和愛德華科技公司合作開發的一種單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)以及突變研究的工具。它通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結合情況，來判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、是否是雜合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點與不同基因型。這種檢測方法不受突變堿基位點與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。該方法無需設計探針，操作簡便、快速，成本低，結果準確，并且實現了真正的閉管操作。在植物育種上，HRM可用于突變掃描、基因分型、基于特定基因的種質資源鑒定以及功能標記開發等方面，對于SNP、InDel等多種標記的開發和利用具有重要的價值。

通過本團隊自主開發設計的水稻60K基因芯片對谷梅4號、武運粳7號和9311進行全基因組掃描，選擇在Pigm基因兩端附近谷梅4號與武運粳7號和9311都不同的變異位點來設計HRM引物，在兩端各開發一個與Pigm完全共分離的分子標記，并建立中高通量輔助選擇體系，能夠大大提高水稻抗病育種選育的效率。

發明內容