[發明專利]一種胞外囊泡/脂質體的定量方法

在審

• 申請號: 201710207680.8
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106906294A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 王本;田慶常;賀川江
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 鄭海峰

1.一種胞外囊泡/脂質體的定量方法，其特征在于包含如下步驟：

1)將錨定分子與核酸連結；

2)將連接后的錨定分子-核酸復合物與胞外囊泡/脂質體共孵育，將該復合物錨定到胞外囊泡/脂質體上；

3)過濾掉多余的未與胞外囊泡/脂質體連結的錨定分子-核酸復合物；

4)將連結有錨定分子-核酸復合物的胞外囊泡/脂質體與核酸擴增混合液混合后進行擴增反應，定量。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述的錨定分子為非特異性錨定分子或特異性錨定分子，非特異性錨定分子包括但不限于硬脂酰、膽固醇、糖基磷脂酰肌醇、油烯基鏈及其衍生物，特異性錨定分子包括但不限于抗體、核酸適配體。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于當錨定分子為核酸適配體時；核酸適配體作為錨定分子-核酸復合物直接與胞外囊泡/脂質體共孵育，無需再與核酸連結。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述的核酸為單、雙鏈的DNA或RNA，長度10Kb-200Kb；所述將錨定分子與核酸連結是指通過錨定分子與核酸上基團間的化學反應將二者連結在一起。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述的共孵育是指將錨定分子-核酸復合物與胞外囊泡/脂質體混合后，在10℃—80℃下孵育5min-24h時間。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟3)所述的過濾是指使用10-100KD截留分子量，在4000-10000g條件下離心5-10min，離心3-6次。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟4)中所述的進行擴增反應包括聚合酶鏈式反應擴增、核酸等溫擴增。

8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟4)中的核酸擴增混合液是指含有DNA聚合酶、引物、核酸熒光探針的混合液，混合液中的每一種物質相對于胞外囊泡/脂質體的數目都是過量的。

9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟4)中定量方法包括兩類，一類是基于熒光信號強度進行相對定量，另一類是指對熒光信號點計數進行絕對定量。

10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于所述的對熒光信號點計數進行絕對定量的方法是指：將連結有錨定分子-核酸復合物的胞外囊泡/脂質體與核酸擴增混合液混合后分散到大量的液滴或小室中，進行核酸擴增反應；基于泊松分布，每個液滴或小室至多有一個胞外囊泡/脂質體，統計有熒光信號的液滴或小室數目，即可得到胞外囊泡/脂質體的數目。