[發明專利]過表達靶蛋白的系統和方法

在審

• 申請號: 201710207100.5
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN108660155A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 胡育誠;沈志哲
• 申請（專利權）人: 胡育誠
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 徐金國

本發明提供一種過表達靶蛋白的系統，所述系統包含二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞、葉酸拮抗劑、靶蛋白表達載體和CRISPRi表達載體，其中靶蛋白表達載體包含靶蛋白表達盒和DHFR表達盒，CRISPRi表達載體包含gRNA盒和dCas9表達盒。所述過表達靶蛋白的系統可以顯著提高靶蛋白的產量，并縮短進行基因擴增的時間。

技術領域

本發明涉及一種DNA重組技術，特別是一種使用載體引入外來遺傳材料的DNA重組技術。

背景技術

由于生物體內各種蛋白質控制了生理狀態，因此許多疾病與缺乏某些蛋白質有關。蛋白質藥物屬于大分子藥物，可定義為治療人類疾病而由體外給予的配制蛋白質。蛋白質藥物原料以天然的生物材料為主，包括人體、動物、植物和微生物等，因其低毒性以及與人體兼容的優點，為目前新藥發展趨勢和為我國生物制劑產業發展重要項目之一。

過去蛋白質藥物主要來源為從人(血液或尿液)或動物器官(如胰臟)中萃取。這種方法產率和產量都很低，來源不易取得，因此成本非常高。同時由于各種傳染病(如艾滋病與狂牛病)盛行，很難保證這些藥物不被病原體污染。

以基因工程生產的藥物，利用生物細胞為工廠制造，可在實驗室中篩檢確保不受病原體污染，同時在轉染蛋白質基因時，可利用強啟動子(strong promoter)使蛋白質表達量增強以提升產量。早期的宿主細胞常選用大腸桿菌或酵母菌，因為此類細胞較易培養，容易利用生化反應器放大生產規模，產量較大且培養基較便宜。但大腸桿菌或酵母菌為較簡單的生物，有些蛋白質生產出來會無法適當地折疊成正確的三維形狀，或因無法進行適當翻譯后處理，而使蛋白質缺乏其應有功能或影響到蛋白質的形狀、功能、穩定性和免疫性質等，因此以細菌生產出的蛋白質可能無法達到所要求的藥效。

面對此種狀況，可選用較高等的生物細胞如中國倉鼠卵巢(Chinese hamsterovary,CHO)細胞、人類胚胎腎臟(Human embryonic kidney,HEK)細胞、非洲綠猴腎臟(Vero)細胞等哺乳動物細胞作為生產工具，用以表達需要較精密修飾的蛋白質分子。其中CHO細胞具有不死性，可以傳代百代以上，且對于蛋白進行糖基化的糖型與人類基本一致，此外CHO細胞屬于成纖維細胞(fibroblast)，為一種非分泌型細胞，且本身很少分泌CHO內源蛋白，對靶蛋白分離純化工作十分有利，因此CHO細胞為表達復雜生物大分子的理想宿主。目前CHO細胞基因擴增表達系統常用于生產靶蛋白，先前文獻報導中指出，利用CHO細胞基因擴增表達系統進行基因擴增時，若是逐步增加藥物篩選的壓力能促使目的基因擴增套數增加，但由于需要逐步增加藥物濃度，非常耗時費力，往往需數個月以上才能篩選出高產量細胞株。因此如何有效提高靶蛋白產量并縮短篩選出高產量細胞株始終是相當重要的課題。

發明內容

本發明的一個方面是在提供一種過表達靶蛋白的系統，其包含二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO細胞、葉酸拮抗劑、靶蛋白表達載體和CRISPRi表達載體。靶蛋白表達載體包含靶蛋白表達盒和DHFR表達盒，其中靶蛋白表達盒包含第一啟動子和靶蛋白的基因，DHFR表達盒包含第二啟動子和DHRF基因。CRISPRi表達載體包含gRNA盒和dCas9表達盒，其中gRNA盒包含第三啟動子、gRNA序列和終止子，dCas9表達盒包含第四啟動子、dCas9-KRAB基因以及抗生素耐受基因。

根據上述的過表達靶蛋白的系統，其中所述二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞可為DUXB11細胞株或DG44細胞株。

根據上述的過表達靶蛋白的系統，其中所述葉酸拮抗劑可為甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺酰亞胺(Methionine sulfoximine,MSX)。

根據上述的過表達靶蛋白的系統，其中所述第一啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，所述第二啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，且第二啟動子和第一啟動子不相同。