[發(fā)明專利]一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710204994.2
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN106987591B
• 公開（公告）日: 2020-01-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝雅晶;劉賢金;何鑫;徐重新;張霄
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務(wù)所
• 代理人: 王加貴

本發(fā)明提供了一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因，包括具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其同源核苷酸序列，所述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因包括來自水稻Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice)的RbcS基因及內(nèi)含子序列。本發(fā)明還提供了一種外源基因在植物中誘導(dǎo)表達(dá)的方法，包括將上述載體引入植物愈傷組織細(xì)胞、生長成具有光誘導(dǎo)型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明利用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，獲得含光誘導(dǎo)啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入到植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)對目的基因的定向操作，獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，啟動(dòng)子可以被RNA聚合酶辨認(rèn)，并開始轉(zhuǎn)錄。組成型啟動(dòng)子廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因，如常用于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的CaMV 35S啟動(dòng)子，ubiquitin啟動(dòng)子和actin啟動(dòng)子，它能高效、持續(xù)和非特異的啟動(dòng)外源基因表達(dá)，但外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達(dá)也會(huì)帶來很多負(fù)面影響。例如，增加植物的代謝負(fù)擔(dān)，影響植株的生長發(fā)育，導(dǎo)致植物生長延滯、植株矮小、產(chǎn)量降低等；另外，利用組成型啟動(dòng)子可能誘發(fā)基因沉默，影響轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用；并且，隨著人們對于轉(zhuǎn)基因植物食品安全問題的越來越多的關(guān)注，組成型啟動(dòng)子亦不能滿足現(xiàn)代基因工程育種的要求。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只在某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下或者植物發(fā)育到特定的階段，才啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定時(shí)空積累，增加區(qū)域表達(dá)量，提高植株的抗逆性，同時(shí)可避免由組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因超量表達(dá)引起對植株發(fā)育的負(fù)面影響，也可以在一定程度上解決轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中的基因沉默和食品安全性問題，是應(yīng)用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行基因工程育種的理想啟動(dòng)子。

核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)基因的啟動(dòng)子同時(shí)具有光誘導(dǎo)性和組織特異性。目前，rbcS的啟動(dòng)子在水稻上的應(yīng)用非常廣泛。最早Kyozuka J等從番茄中發(fā)現(xiàn)rbcS基因的啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因水稻中驅(qū)動(dòng)gus基因的表達(dá)，通過檢測GUS活性發(fā)現(xiàn)其只在綠色組織中表達(dá)，具有組織特異性。劉巧泉等克隆番茄Rubisco小亞基rbcS3A基因的5′上游啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)rbcS基因的啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)gus基因在轉(zhuǎn)基因水稻綠色組織中特異表達(dá)，而在種子和根等組織中幾乎不表達(dá)。黃海群等克隆水稻日本晴rbcS基因5′上游序列的啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)gus報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因水稻的胚及胚乳中不表達(dá)，在葉片葉鞘、莖及穎殼中特異表達(dá)。盧碧霞等進(jìn)行了相類似的實(shí)驗(yàn)，對轉(zhuǎn)基因水稻的GUS定量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)rbcS啟動(dòng)子的表達(dá)水平高于CaMV35S組成型啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容

意外地，本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，水稻RbcS基因中的部分序列也具有啟動(dòng)子的特性；例如，申請人發(fā)現(xiàn)水稻日本晴RbcS基因及內(nèi)含子序列(非RbcS基因的啟動(dòng)子序列)，可經(jīng)過光誘導(dǎo)僅在水稻的綠色組織中表達(dá)外源基因，根、籽實(shí)(胚及胚乳)中不表達(dá)，并伴隨植物生理狀態(tài)(新葉中高效表達(dá)，老葉中低效表達(dá))進(jìn)行適度表達(dá)。這種來源于水稻RbcS基因及內(nèi)含子序列來源的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有利于解決轉(zhuǎn)基因水稻中籽實(shí)的食品安全性問題，且不影響植株的生長發(fā)育。

有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因，其為下列核苷酸序列之一:

1)具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

2)或與如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列同源性至少70％、80％、90％或95％的核苷酸序列；

3)或經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能蛋白質(zhì)、由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因中，所述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因包括來自水稻RbcS基因及內(nèi)含子序列。