[發明專利]一種肝素酶高產菌株及其選育方法

有效

• 申請號: 201710203311.1
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN107189956B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 趙麗青;劉文麗;蔣瑩子
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市興科達知識產權代理有限公司 44260
• 代理人: 王翀

本發明提供了一種肝素酶高產菌株，菌株為：Raoultella SP.NX?TZ?3,15；該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2017年3月6日，保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號：CGMCC No.13723。該肝素酶高產菌株的選育是利用魚精蛋白和肝素反應產生的沉淀作為指示物，微生物產生的肝素酶裂解肝素反應使沉淀消失，菌體周圍產生透明圈，從而起到對肝素酶源微生物菌株直接指示的作用，通過復篩、16S rDNA方法鑒定產肝素酶菌株Raoultella SP.NX?TZ?3,15，本發明解決了肝素酶源微生物原有篩選方法耗時、耗力、耗材的弊端，利用魚精蛋白和肝素反應生成的沉淀作為指示物，大大的節省人力、物力和時間。

[技術領域]

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種肝素酶高產菌株Raoultella SP.NX-TZ-3,15及其 選育方法。

[背景技術]

肝素酶(Heparinase)或肝素裂解酶是一類能夠專一性地裂解肝素和硫酸類肝素糖苷鍵的 蛋白質。肝素酶最早是從肝素黃桿菌中發現的，肝素黃桿菌是一種能夠利用肝素產生寡糖的 微生物，臨床上主要用來預防血栓或作為體外抗凝血藥物使用。

目前，從肝素黃桿菌中已經鑒定出三種肝素酶：肝素酶Ⅰ(heparinase,EC4.2.2.7)，肝素 酶Ⅱ(heparinase II)，和肝素酶Ⅲ(heparinase,EC 4.2.2.8)。肝素酶Ⅰ主要裂解肝素，肝素酶 Ⅲ主要裂解硫酸類肝素，肝素酶Ⅱ可同時裂解肝素和硫酸類肝素。肝素黃桿菌主要用于低分 子肝素和超低分子肝素的生產，特別是肝素酶I和肝素酶II。

除了從肝素黃桿菌中分離出肝素酶外，國內外學者還先后從土壤和食物研磨廢物中分離 出鞘氨醇桿屬和芽孢桿菌屬產肝素酶。此外，還有一些學者從人體腸道、人體牙周和土壤中 分離出糞便擬桿、黃曲霉和不動桿菌產肝素酶。

目前產肝素酶微生物的篩選方法主要是采用肝素逐步取代微生物篩選培養基原始碳源的 馴化方法，特異性富集對肝素具有裂解能力的微生物菌株，然后以天青A法監測富集培養液 中肝素的含量變化，初步篩選到含有能利用肝素的菌株的樣本，在對樣本中各菌落涂布，挑 取單菌落進行復篩，復篩主要是將初篩的菌株培養，然后制備無細胞粗提液，進行破碎，利 用天青A法測定酶活力從而確定是否是產肝素酶的微生物，但這種篩選方法需要嘗試多種配 方培養基，浪費大量的人力和物力，因此探究一種簡單快速的篩選產肝素酶微生物的方法具 有極其重要的意義。

[發明內容]

針對現有技術存在的不足，本發明提供了一種肝素酶高產菌株及其選育方法，利用此方 法能夠篩選出肝素酶高產菌株。

一方面，本發明提供一種肝素酶高產菌株，菌株為：Raoultella SP.NX-TZ-3,15；該菌株 已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2017年3月6日，保藏單位名稱：中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號：CGMCC No.13723。

另一方面，本發明提供一種肝素酶高產菌株的選育方法：利用魚精蛋白和肝素反應的沉 淀作為指示物，肝素酶裂解肝素反應使菌體周圍產生透明圈，從而起到對肝素酶源微生物菌 株直接指示的作用，通過復篩、16S rDNA方法鑒定產肝素酶菌株RaoultellaSP.NX-TZ-3,15；

具體包括以下步驟：

步驟一，肝素酶產生菌的富集培養：將1g采集的樣品加入盛有10mL無菌生理鹽水的試 管中搖勻后，取5mL懸浮液，或直接取5mL水樣，加入盛有25mL富集培養基的三角瓶中，200r/min，37℃搖瓶培養2天；