[發明專利]寬場三維超高分辨定位和成像方法與裝置

有效

• 申請號: 201710202764.2
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN107356566B
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 匡翠方;鄭程;黃玉佳;劉旭;劉向東;張克奇;毛磊
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/01
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種對完整細胞的寬場三維超高分辨定位和成像方法，其特征在于，包括：

調制入射光的偏振狀態，變成P偏振光或S偏振光；

調制后的光束在變為切向偏振光或者徑向偏振光后對樣品進行照明；

利用入射角大于全內反射臨界角的光產生的倏逝波照明細胞的下表面；

利用入射角度小于全內反射臨界角透射光和其被細胞上表面反射一次后的反射光干涉產生的圖案照明細胞的上表面；

根據采集的樣品發出的熒光信息，重構完整細胞的三維超分辨圖像。

2.如權利要求1所述的寬場三維超高分辨定位和成像方法，其特征在于：當入射角度θ₁大于全反射角時，激發的倏逝波場沿著z軸呈指數衰減，在細胞的下表面附近激發熒光，通過改變照明角度來改變衰減系數，實現z軸的差別照明。

3.如權利要求1所述的寬場三維超高分辨定位和成像方法，其特征在于：產生全內反射照明時，得到的熒光強度其分布滿足公式：

其中θ為入射角，z為軸向深度，α為激發光的入射角，為激發光的方位角，I代表電場強度，ρ為發散角的激光光束強度的空間分布，Ω為光束的發散角，f為軸向的熒光分子強度。

4.如權利要求1所述的寬場三維超高分辨定位和成像方法，其特征在于：細胞上表面設置依次鍍有硅膜和二氧化硅膜用于增強反射效應的蓋玻片。

5.如權利要求4所述的寬場三維超高分辨定位和成像方法，其特征在于：干涉產生的照明圖案強度分布滿足公式：

E～1+r^TEexp[iφ(H)]，

其中r^TE是與界面垂直的電場分量的菲涅爾反射系數，φ(H)是透射光與反射光之間的相位差；

與軸向位置H相關的φ(H)滿足公式：

菲涅爾反射系數滿足公式：

p₀＝n_Si cosθ_Si，p₁＝n_ox cosθ_ox，p₂＝n_b cosθ_b，

其中，λ為入射光真空中的波長，為特征矩陣M_TE的四個參數，k_i為不同材料中的波矢；n_Si，n_ox，n_b分別為硅、二氧化硅和樣品中的折射率；θ_Si，θ_ox，θ_b分別為硅、二氧化硅和樣品中的入射光角度；d_ox為二氧化硅膜層的厚度。

6.如權利要求1所述的寬場三維超高分辨定位和成像方法，其特征在于：入射光在顯微物鏡的后焦面上以不同的入射角對樣品進行環形掃描。

7.如權利要求1所述的寬場三維超高分辨定位和成像方法，其特征在于：在調制后的光束轉換為切向偏振光或者徑向偏振光時，采集熒光信息的探測器上的光強分布符合泊松分布，且隨偏振的改變呈周期性變化，可表示為：

I(r,θ)～Poisson(μ(r,θ))

f(θ,α_i)＝cos²(α_i-θ)

其中，μ為到達探測器的光子數，r為探測器上位置，θ為激發光的偏振角度，I₀為由于系統響應不穩定引入的與偏振相關的周期性校正因子，U為系統的點擴散函數，g₀(r_i)和α_i分別為位置為r_i的第i個輻射偶極子的極化強度和極化方向，b(r)為短時間內偏振不穩定的背景，f(θ,α_i)為隨入射光偏振方向改變的有效輻射光子率。