[發(fā)明專利]一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710201645.5
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN107019816A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江蕾微;陸洪光;聶瑛潔;盛良;馬婷;時光
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州省人民醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 常州市華信天成專利代理事務(wù)所(普通合伙)32294
• 代理人: 何學(xué)成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織工程皮膚技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法。

背景技術(shù)

近年來，各種組織工程皮膚如Apligraf VR、Dermagraft VR等已應(yīng)用于臨床進(jìn)行創(chuàng)面的修復(fù)。現(xiàn)組織工程皮膚的種子細(xì)胞大多是同種異體的角質(zhì)形成細(xì)胞，但從諸多方面考慮，角質(zhì)形成細(xì)胞并不是一種理想的種子細(xì)胞。為使組織工程皮膚更好的應(yīng)用于臨床，用羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)作為種子細(xì)胞將是一個更好、更有新意的選擇。hAECs較其他細(xì)胞更有優(yōu)勢在于它具有向三個胚層分化的可塑性，且它表達(dá)生長因子(EGF、KGF、HGF)及抗炎和抗菌的細(xì)胞因子，這些有利于創(chuàng)面的愈合。因羊膜是產(chǎn)后廢棄物，取材容易，且無倫理學(xué)爭議。重要的是，hAECs與人類的胚胎干細(xì)胞不一樣，它不表達(dá)端粒酶，故在移植時不會形成腫瘤。因hAECs免疫源性低，因此在移植后發(fā)生免疫排斥的風(fēng)險很低。故hAECs在組織工程皮膚再生中是一個有前景的種子細(xì)胞。

除種子細(xì)胞外，選擇合適的真皮替代物是構(gòu)建組織工程皮膚的關(guān)鍵。雖然目前大多數(shù)的真皮替代物能夠模擬真皮的結(jié)構(gòu)和功能，但幾乎都缺乏有效的基底膜結(jié)構(gòu)和功能，表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞在這種缺乏基底膜的真皮替代物上會逐漸失去增殖能力。為解決這一問題，越來越多的研究者都在尋求一種具備基底膜結(jié)構(gòu)的真皮支架。大量研究表明通過在真皮替代物上添加天然或人工合成的基底膜成分，體外構(gòu)建的模型中表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖會明顯增強(qiáng)，且形成的人工表皮層的功能也有明顯的改善。去表皮的真皮組織(DED)是把皮膚組織從基底膜(BM)的透明層處去除表皮而獲得的，故在DED的表面保留了大多數(shù)的基底膜成分，如層粘蛋白、IV型膠原和VII型膠原等。故具有完整基底膜結(jié)構(gòu)的DED有利于hAECs的分化、復(fù)層、角化，使得構(gòu)建的組織工程皮膚與正常人皮膚更加接近。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法，構(gòu)建的組織工程皮膚模型中表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)，且形成的人工表皮層的功能也有明顯的改善，為組織工程皮膚的構(gòu)建提供一種新的更好的選擇。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法，是以人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)作為種子細(xì)胞，以人去表皮的真皮組織(De-epidermized dermis,DED)作為支架材料，將種子細(xì)胞種植于支架材料上構(gòu)建hAECs-DED組織工程皮膚，包括以下步驟：1)hAECs的分離培養(yǎng)；2)成纖維細(xì)胞(FB)的分離培養(yǎng)；3)DED的制備；4)hAECs-DED組織工程皮膚的構(gòu)建。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述hAECs的分離培養(yǎng)具體方法為：將羊膜組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)加以沖洗后剪成細(xì)碎小塊，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，37℃消化10min，棄消化液(主要去除雜細(xì)胞和細(xì)胞碎片)；后重復(fù)上述方法消化上皮細(xì)胞，37℃消化30-40min，200目不銹鋼網(wǎng)過濾；收集單細(xì)胞懸液，加含10％胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；過濾后組織碎片用同樣方法重復(fù)消化1次；離心收集的細(xì)胞用添加10ng/ml EGF的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％CO₂孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；24h首次換液，后每3天全量換液一次，約10天后細(xì)胞可按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)；第二代hAEC細(xì)胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分別進(jìn)行Oct-3/4、SSEA-4免疫熒光檢測。