[發明專利]全血直接擴增核酸檢測葉酸代謝相關基因多態性的方法

在審

• 申請號: 201710200250.3
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN106868180A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 蘇宇曲;孫濤
• 申請（專利權）人: 浙江中迪生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司11241
• 代理人: 解政文

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測，尤其涉及一種全血直接擴增核酸檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物、引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

PCR是一種利用DNA聚合酶將極微量的標本百億倍甚至千億倍擴大的現代技術，其起始模板通常是基因組DNA。人類基因組DNA主要來源于血液，需要對其進行提取，除了商品化試劑盒外，還有很多其他的提取方法，如：酚/氯仿抽提法、碘化鉀法、直接煮沸法、高鹽沉淀法等。這些方法雖然有效，但是操作步驟繁瑣，容易造成污染，而且基本上都需要用到恒溫水浴鍋、低溫高速離心機等裝置，對儀器設備和試劑的要求都比較多。如果不經過DNA提取而直接進行PCR，則可以大大節約實驗時間和成本，同時也避免了因多步操作可能造成的樣本間交叉污染。已有文獻報道采用全血直接進行DNA擴增。如：McCusker J.等人對一定量的全血標本95℃預處理15分鐘，以降低血液中的PCR抑制成份對擴增的影響；Mercier B在全血擴增前利用3個循環的預變性程序來去除血液中的PCR抑制成分等。這些方法雖然以全血為起始模板直接擴增DNA，但操作不夠簡便，條件難以控制，重復性不好，不能形成商品化試劑盒，不利于推廣使用，且相關研究未見后續進一步報道。

科學研究發現，葉酸利用能力受遺傳結構(基因)影響，如果與葉酸代謝相關的酶活性偏低(即相關基因功能異常)，這一人群如按常量(400微克/天)補充葉酸，機體葉酸水平也會不足。遺傳體質的差異導致了機體對葉酸利用能力的差異，因此，葉酸增補應因人而異，增補過多或過少都不利于胎兒健康和孕婦健康。

科學研究已經證實，與甲基類維生素(葉酸及維生素B12)代謝密切相關的基因是MTHFR。MTHFR編碼蛋白5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶，其基因變異會引起相應的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸轉化為甲硫氨酸，導致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥，從而增加新生兒出生缺陷風險或自發性流產等風險。

MTHFR全稱5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶)，位于一號染色體1p36.3位置。MTHFE全長19.3kb，mRNA全長7105bp，共有外顯子12個，編碼共有657個氨基酸編碼子的蛋白。亞甲基四氫葉酸還原酶催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉換成5-甲基四氫葉酸鹽，使之能為同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。該酶是人體葉酸代謝中的一個十分重要的酶。

目前市面上檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)的兩個SNP位點多態性的方法都是需要從人全血或口腔上皮組織中抽提人基因組DNA，然后在熒光定量PCR儀上，利用熒光探針或熒光染料法進行熒光定量PCR，根據熒光信號強弱或溶解曲線來判斷突變類型。這些方法雖然可以做到當天出結果，但是不適合國內二三線城市的醫院或婦幼保健院內檢測。原因如下：

1、熒光定量PCR儀價格昂貴，國產儀器售價也超過幾十萬元，不是所有醫院都能配備；

2、試劑盒在不同廠家或不同型號的熒光定量PCR儀上判讀方法或結果不一致，需要做預實驗或測序驗證后才能大規模檢測；

3、需要抽提基因組DNA，額外增加檢測人員工作量及檢測成本，并且容易造成樣本污染。

發明內容

本發明的目的是提供一種適用于二三線城市的醫院或婦幼保健院內檢測的葉酸代謝相關基因多態性的方法。

一種利用全血直接擴增核酸檢測葉酸代謝相關基因多態性的方法，包括取全血樣本為起始材料，加入核酸擴增反應試劑，加入擴增目的基因引物，直接進行核酸擴增反應，測定擴增產物，擴增核酸反應試劑為BR Taq聚合酶，所述基因引物的引物和探針序列如下：

用于MTHFR C677T型多態性位點檢測的引物：

MTHFR C677T-seq-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；

MTHFR C677T-seq-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；

2)用于MTHFR A1298C型多態性位點檢測的引物：

MTHFR A1298C-seq-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；

MTHFR A1298C-seq-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’。

作為本發明的進一步改進，所述BR Taq聚合酶位于緩沖液條件下，所述緩沖液的pH值為8.8，鉀離子濃度為95mmol/L。