[發(fā)明專利]一種新型抗菌肽Mytichitin?A在畢赤酵母中的高效制備

在審

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• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN106995494A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發(fā)明（設計）人: 樊振川;孟德梅;代紅霞;高曉芳;楊永海
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/81;C12N1/19;A61K38/17;A61P31/04;A23L3/3526;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)11617
• 代理人: 郭曉迪

技術領域

本發(fā)明涉及抗菌肽Mytichitin-A首次通過基因工程的方法成功表達于畢赤酵母中且具有較強抑菌活性，屬于生物技術領域。

背景技術

抗菌肽是在誘導條件下，由機體細胞產(chǎn)生的用于對抗外源性致病菌的一種活性多肽。近些年，對抗菌肽的研究越來越多，不僅僅因為其在殺滅細菌和真菌、抗病毒、抗腫瘤等多方面的作用，更因為其在人體內(nèi)易消化、無毒副作用、熱穩(wěn)定性好、無藥物殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等諸多優(yōu)點，使其被世界公認為最具潛力的抗生素和食品防腐保鮮劑替代品，具備巨大的開發(fā)潛力。Mytichitin-A是從厚殼貽貝(Mytilus coruscus)的血清中分離純化得到，是一種十分典型的陽離子抗菌肽，由55個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為6261.55Da，包含三對二硫鍵，同源的抗菌肽結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，其序列中第17到第55個氨基酸殘基構(gòu)成了幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Mytichitin-A對革蘭氏陽性菌有明顯的抑菌活性，特別是對金黃色葡萄球菌極其敏感。這使得Mytichitin-A在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥上都具有巨大應用潛力。

畢赤酵母(Pichia pastoris)作為一種新的酵母表達系統(tǒng)被人們發(fā)現(xiàn)。由于畢赤酵母與釀酒酵母的分子及遺傳操作方式相似，并且畢赤酵母表達外源蛋白的水平比釀酒酵母高出好多倍，這使得畢赤酵母成為目前應用最廣泛的表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)。這個新的表達系統(tǒng)有很多優(yōu)點1、產(chǎn)生的蛋白來源于自身的非常少，且培養(yǎng)畢赤酵母的培養(yǎng)基只含有少量的蛋白，這使得分泌的外源蛋白成為酵母培養(yǎng)液中蛋白的主要組成部分，可作為蛋白純化的第一步。2、畢赤酵母擁有可嚴格調(diào)控的乙醇氧化酶基因啟動子，這是目前啟動能力最強的啟動子之一，能夠以甲醇作為唯一碳源，驅(qū)動外源基因在畢赤酵母中表達。3、整合到畢赤酵母基因組上的外源基因，隨著染色體的復制而復制，可穩(wěn)定遺傳。4、pH適應范圍廣，可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值來抑制蛋白水解酶的活性，從而降低蛋白酶對目的蛋白的水解。

以畢赤酵母為表達載體，利用甲醇進行誘導表達，首次獲得了抗菌肽Mytichitin-A的高表達菌株，并經(jīng)抑菌試驗實驗，確定其對致病菌金黃色葡萄球菌有很強的抑菌作用。經(jīng)檢索本發(fā)明在國內(nèi)外未見公開報道，在國內(nèi)外未見公開使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種新型重組抗菌肽Mytichitin-A在畢赤酵母中高效制備的方法。技術方案概述如下：以畢赤酵母為宿主細胞，將新型抗菌肽Mytichitin-A的基因序列插入到pPICZαA載體，并成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，利用甲醇就行誘導表達，對表達產(chǎn)物進行純化及活性鑒定。終產(chǎn)品是新型重組抗菌肽Mytichitin-A的高表達菌株，發(fā)酵液上清中抗菌肽產(chǎn)量達45.5μg/mL。所制備重組抗菌肽對多種病原菌均具有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果格外突出。

本發(fā)明的另一目的是提供一種新型重組抗菌肽Mytichitin-A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，本發(fā)明還提供一種包含上述重組抗菌肽Mytichitin-A的克隆載體、表達載體或宿主細胞。

更進一步地，所述克隆載體為pUC19，所述表達載體為pPICZαA，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115。

所述新型重組抗菌肽Mytichitin-A在畢赤酵母中高效制備的方法，具體包括如下步驟：

(1)按照SEQ ID NO：2合成抗菌肽Mytichitin-A目的基因并插入到載體pUC19，獲得重組質(zhì)粒pUC-Mytichitin-A，采用表達載體pPICZαA以及EcoRI和KpnI兩個限制性酶切位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZα-Mytichitin-A；

(2)通過電轉(zhuǎn)化的方法，將SacI酶線性化的重組質(zhì)粒pPICZαA-Mytichitin-A轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細胞，構(gòu)建基因工程重組菌；

(3)篩選pPICZαA-Mytichitin-A的陽性克隆子進行誘導表達，獲得存在于酵母發(fā)酵液上清中的目的蛋白。

進一步的，采用pPICZαA這一外分泌型表達載體，載體上有可嚴格調(diào)控的乙醇氧化酶基因(Aox1)啟動子及α-因子分泌信號(α-factor)，促進外源蛋白分泌表達。

進一步地，誘導表達的條件為，當用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)pPICZαA-Mytichitin-A陽性克隆子的OD值為6.0-8.0時，換成BMMY培養(yǎng)基，并用甲醇進行誘導表達。

更進一步地，經(jīng)1.0％甲醇誘導96h，目的蛋白產(chǎn)量達45.5μg/mL。