[發明專利]檢測結核分枝桿菌感染的抗原多肽池及其應用

有效

• 申請號: 201710198834.1
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN107011418B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 黃俊;陳銀芳;張詩冉;丁曉莉;趙平鋒
• 申請（專利權）人: 武漢海吉力生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

本發明公開了一種用于檢測結核分枝桿菌感染的抗原多肽池，該特異性抗原多肽池，特異性刺激結核分枝桿菌感染的新鮮全血能特異性的分泌IFN?γ，增加檢測靈敏度。本發明提供了一種新的可用于結核分枝桿菌感染檢測的檢測試劑，實驗證明，本發明可直接利用外周血進行抗原刺激，無需分離外周血單個核細胞，實驗數據顯示用于結核分枝桿菌感染檢測具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡便，成本較低，具有較高的臨床應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及檢測結核分枝桿菌感染的抗原多肽池及其應用。

背景技術

結核病是主要經呼吸道傳播的、嚴重危害我國和全世界的重要傳染病之一。據世界衛生組織，全世界有17-20億的結核分枝桿菌感染者，每年至少200萬人死于本病(謝建平，結核分枝桿菌功能基因組研究的方法學，微生物通報.2001.28(5):92-97)。因此，準確篩檢感染者的方法在結核病的防治甚至最終的消滅中扮演極其重要的作用。

現有的診斷技術對結核分枝桿菌感染者的診斷非常難。近幾十年來，臨床上采用結核菌素試驗(TST)來診斷結核分枝桿菌感染者。但TST活性成份是純蛋白衍生物(purified protein derivative of tubercμLin，PPD)，是結核分枝桿菌培養上清液的粗提物，含有200多種成分，與卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)接種和環境分枝桿菌感染存在交叉反應。TST檢測結果可被現在臨床廣泛使用的疫苗—卡介苗免疫所干擾[P.Andersen，et al.Lancet356(2000)1099-1104.]。從1921年及明卡介苗到現在為止，全世界已有35億人接種卡介苗。因此TST對感染者的診斷價值受到很大的影響，導致TST診斷的準確性較低，因此，無法根據其結果判斷是否真正存在結核分枝桿菌感染。

對結核病病人的診斷技術中，痰涂片抗酸染色或痰菌培養，培養困難，耗時較長；肺部x射線檢查肺部病理改變，也僅在具有典型的臨床癥狀后才能診斷；其他血清學診斷方法和分子診斷方法缺乏特異性，假陽性率較高。有關研究人員指出，不同診斷性檢查方法的敏感性和特異性如下：分枝桿菌培養(分別為73％和100％)；PCR(分別為42％和100％)；胸部X線(分別為67％～77％和66％～76％)；結核菌素試驗(分別為94％和20％)；血清學(分別為33％和87％)。由此可見，現有的結核分枝桿菌檢測方法的敏感性和特異性無法同時達到最優。

結核分枝桿菌感染人體后，首先會被人體的免疫系統識別，激活機體的T細胞免疫應答，分泌產生γ干擾素(IFN-γ)，后者發揮抗結核感染作用。部分T細胞轉化為免疫記憶細胞，當再次與結核分枝桿菌相遇后，會再次分泌產生IFN-γ，發揮抗結核感染作用。抗原特異的刺激產生IFN-γ及其產生量與機體是否感染或發病密切相關。因此，如果采用結核分枝桿菌特異的抗原在體外刺激感染者和患者的T細胞，可誘導這些T細胞產生高水平的結核分枝桿菌特異的IFN-γ，而非結核分枝桿菌感染者或非結核病患者產生的IFN-γ的量與未用抗原刺激產生的量相近，從而實現診斷的目的。由此可見，尋找并發現結核分枝桿菌特異性抗原，對發展新一代的檢測試劑具有重要價值和意義。

1996年，Stover等通過減數雜交的方法確定了BCG在體外傳代過程中丟失的域，定義為缺失區(Region of Difference，RD)，RD區域存在于結核分枝桿菌中，而在BCG和大多數環境分枝桿菌中缺失[程渝,李茂全.結核分枝桿菌的實驗室診斷進展.國外醫學臨床生物化學和檢驗學分冊.2002；23(6)：342-343.]。其中，RD1區域編碼的早期分抗原靶6KD(early secreting antigen target 6KD，ESAT-6)和培養濾液蛋白10KD(cμLtufiltrateprotein 10KD，CFP-10)是兩種小分子量分泌蛋白，它們是T細胞最主要的抗原之一，可以誘導較強的細胞免疫反應。