[發明專利]特異性快速檢測柑橘僵化病病原的引物對及試劑盒與應用

有效

• 申請號: 201710197478.1
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106834522B
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 宋曉兵;彭埃天;崔一平;程保平;凌金鋒;陳霞
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 44245 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 崔紅麗;裘暉

本發明公開一種特異性快速檢測柑橘僵化病病原的引物對及試劑盒與應用。該引物對是基于柑橘僵化病病原(Spiroplasma citri)的膜蛋白基因序列設計的特異性PCR引物對，其序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。本發明能夠特異性檢測柑橘螺原體(Spiroplasma citri)，無需進行螺原體的分離培養，可以直接從柑橘總DNA中檢測病原。本發明檢測靈敏度高，可檢測低至10^?5ng/μL的柑橘總DNA中的螺原體。本發明檢測耗時較短，經濟適用，總體流程在3～4小時，單個樣品的檢測費用成本僅5～6元。

技術領域

本發明涉及一種外來入侵植物病害的檢測技術，特別涉及一種特異性快速檢測柑橘僵化病病原的引物對及試劑盒與應用。

背景技術

螺原體是一種直徑約為100～250nm，基本形態為螺旋形的無細胞壁的原核微生物。1973年建立了螺原體屬(Spiroplasma)，目前發現的螺原體，根據血清學特性將其分為34個血清組，并已確立了37個螺原體種。螺原體和宿主的關系可分為共生(Mutualism)、互生(Commensalism)和致病(Pathogenic)3種，其中致病螺原體可導致蜜蜂的“五月病”和“爬蜂病”，蝦蟹顫抖病，柑橘僵化病(Citrus stubborn)、玉米矮縮病等，對蜜蜂業、水產養殖業和農業生產造成嚴重影響。

植物螺原體主要存在于植物篩管部和吸食植物汁液的昆蟲體內，這些昆蟲只是螺原體傳播的媒介，絕大多數植物病原性的螺原體對介體昆蟲并不致病。柑橘僵化病是由韌皮部限制的螺原體(Spiroplasma citri)引起的，田間通過柑橘葉蟬傳播的。病原感染大多數柑橘品種和栽培品種，主要分布在熱帶和干旱的柑橘種植區，包括美國加利福尼亞、亞利桑那州，北非，東地中海盆地和中東。受侵染的柑橘導致嚴重發育不良，葉片致密且異常直立，葉片褪綠，類似營養缺乏癥狀，后期造成嚴重的產量損失。

螺原體由于沒有細胞壁、個體微小，相比于其它微生物，螺原體的分離、顯微鏡檢查等方法都比較困難，國內除王文等對蝦蟹中的螺原體研究較深入外，其它種類螺原體僅限于分離鑒定和生物學特性的研究。2004年王文等基于細菌16S rDNA，利用PCR技術檢測河蟹顫抖病的病原，研究發現病原是一個螺原體新種，命名為中華絨螯蟹螺原體；2012年李霞等利用細菌的16S rDNA通用引物擴增并測序比對，檢測到蜜蜂中的一株新的致病螺原體。目前螺原體的檢測主要是基于細菌的16S rDNA序列，首先需要進行螺原體的培養，再提取螺原體的DNA，然后利用細菌通用引物進行PCR擴增，最后需要進一步的測序比對驗證試驗結果。為進一步提高特定螺原體的檢測效率和靈敏度，還需要探索尋找其它基因或核酸片段應用于特定螺原體的特異檢測，無需進行繁瑣的螺原體培養過程，直接從宿主總DNA中特異檢測螺原體病原。

柑橘螺原體已經列入中國外來入侵物種數據庫，柑橘僵化病在國內尚未見田間報道，隨著全球經濟一體化進程加快，需要加強對外來柑橘病害的檢疫檢測，一套良好的柑橘螺原體檢測方案對病原體的檢測以及病害的預防和控制都非常重要。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種特異性快速檢測柑橘僵化病病原的引物對。

本發明的另一目的在于提供一種特異性快速檢測柑橘僵化病病原的試劑盒。

本發明的再一目的在于提供上述特異性快速檢測柑橘僵化病病原的引物對或試劑盒的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

本發明提供一種特異性快速檢測柑橘僵化病病原的引物對，該引物對是基于柑橘僵化病病原(Spiroplasma citri)的膜蛋白基因序列設計的特異性PCR引物對，其序列如下：

上游引物Scf：5'-CACCTGCAACTGTAGCAACA-3'；(SEQ ID No：1)