[發(fā)明專利]一種具有生物活性的COX52?69多肽的固相合成方法及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710194719.7
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106929488A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 李臣鴻;白天宇;王梅杰
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;A61K38/44;A61P5/50;A61P3/04
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所42214
• 代理人: 劉天鈺

技術領域

本發(fā)明提供了一種采用化學合成的方法-Fmoc法合成COX_52-69多肽的工藝，采用該方法所合成的COX_52-69多肽在動物體內體外實驗，證明其具有生物活性；并且本發(fā)明中還提供了所述COX_52-69多肽的用途，屬于生物醫(yī)藥技術領域。

背景技術

短肽COX_52-69是一條含有18個氨基酸的多肽，最初是從豬的小腸中分離純化出來的，經氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)其與細胞色素氧化酶Ⅷ的第52至69完全重疊，所以命名COX_52-69。其序列為LLPAGWVLSHLDSYKKRE。用生化分離純化得到的COX_52-69多肽做功能實驗發(fā)現(xiàn)該多肽能夠抑制葡萄糖引起的胰島素的分泌，該發(fā)現(xiàn)目前已于2013年10月11日申請中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?01310471571.9。在該專利申請中通過從生物組織(豬腸道)中分離純化獲得COX_52-69多肽，但是從生物組織中分離純化獲得COX_52-69多肽是一個高成本的過程。為此需要尋求一種非生化分離的方法以獲取有活性的該肽，并能夠提高了產量和降低了成本。然而在本領域中，雖然通過化學合成或生物工程的方法獲得一個多肽是件容易的事，但是這些獲得的多肽通常是沒有生物活性的。

發(fā)明內容

本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術中的不足，提供了一種具有生物活性的COX_52-69多肽的固相合成方法，并且利用化學合成的COX_52-69多肽在動物體內體外實驗，均發(fā)現(xiàn)化學合成的COX_52-69多肽有抑制葡萄糖引起的胰島素分泌的功能和減輕體重的作用，即具有生物活性。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術方案為：

一種具有生物活性的COX_52-69多肽的固相合成方法，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：LLPAGWVLSH LDSYKKRE，所述固相合成方法包括以下步驟：

(1)、縮合反應：使用DMF預溶脹樹脂，濾去溶劑備用；向反應柱中加入脫保護試劑，反應后脫去樹脂上的的FMoc保護基團，抽干，繼續(xù)采用DMF清洗后抽干，并檢測；

稱取第一個Fmoc-氨基酸Fmoc-GLu(tBu)-OH，同時稱取HOBt備用，將二者同時加入反應柱中，并且溶于DCM中，然后加入DIC并攪拌；稱取DMAP投入反應柱中；氨基酸與反應試劑一同反應，反應完畢后抽干并用DMF清洗；向反應柱中加入脫保護試劑，反應后，脫去樹脂上的的FMoc保護基團，抽干，繼續(xù)采用DMF清洗后抽干，并檢測；

接下來的按照COX_52-69多肽的順序重復添加肽鏈上的下一氨基酸，直至整條肽鏈18個氨基酸全部添加完成并檢測通過；全部完成后，使用無水甲醇清洗并使用抽濾瓶將其抽干；

(2)、肽鏈的切割：在抽干的合成肽樹脂中加入切割液，在通風櫥中室溫攪拌裂解，使用砂芯漏斗過濾除去樹脂，收集濾液，濾液經乙醚萃取后放置于干燥瓶內進行干燥，直至其成為白色粉末，即制得多肽粗品；

(3)、粗肽的檢測和純化：利用高效液相色譜檢測合成的多肽粗品，并分析合成產物中多肽的純度；

(4)、肽的質譜鑒定：用質譜檢測多肽粗品的分子量，確定合成的多肽是否是目標產物，最后將收集的樣品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入樣品杯中，冷凍過夜，次日用真空干燥劑冷凍干燥，最后獲得的白色粉末狀物質即為純品COX_52-69多肽。

步驟(1)中所述脫保護及縮合反應的檢測方法如下：檢測時分別取三滴5％茚三酮無水乙醇溶液和三滴80％苯酚無水乙醇溶液與待檢測樹脂顆粒充分混勻，105℃加熱5min，觀察顏色變化，若變藍色或紫色，則說明游離氨基存在，脫保護完全；若為亮黃色或無色則表示縮合完全，能夠繼續(xù)進行下一個縮合反應。

步驟(1)中在合成每一個氨基酸時，反應過程中維持溫度在25℃～28℃。

步驟(2)中萃取的步驟為：在濾液中按1：10的體積比加入事先4℃下預冷的乙醚，進行萃取，再以每分鐘3000轉的速度離心2分鐘，并使用乙醚清洗離心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分鐘離心。