[發(fā)明專利]一種調(diào)控玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中鈣離子濃度的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710193362.0
• 申請(qǐng)日: 2017-03-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107047539B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙學(xué)明;王娜;朱化彬;李崇陽(yáng);趙亞涵;郝海生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種調(diào)控玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中鈣離子濃度的方法，其特征在于，將體外成熟22h的牛卵母細(xì)胞置于含BAPTA-AM的體外成熟液中孵育2h，然后采用OPS法進(jìn)行冷凍，采用含10μM BAPTA-AM和1μM RR的玻璃化冷凍液進(jìn)行冷凍，解凍后在含RR的體外成熟液中恢復(fù)30min；

所述含BAPTA-AM的體外成熟液為含有5-20μM BAPTA-AM的體外成熟液；

所述含RR的體外成熟液為含有0.5-2μM RR的體外成熟液；

所述體外成熟液為含有10μg/mL FSH、10μg/mL LH、1μg/mL雌二醇和10％ FBS的M199培養(yǎng)液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體置于體外成熟液中培養(yǎng)22h，然后用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，收集MII期卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含BAPTA-AM的體外成熟液中孵育2h；

2）將卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中孵育30s，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中處理25s，然后裝入OPS管中直接投入液氮中凍存；

3）解凍時(shí)，將OPS管從液氮中取出，將裝有卵母細(xì)胞的部分迅速置于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中，用吸管將卵母細(xì)胞從OPS管吹出放于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中1min，然后轉(zhuǎn)入38.5℃含0.15M蔗糖的DPBS溶液中5min，進(jìn)行解凍；

4）解凍后，將卵母細(xì)胞在含RR的體外成熟液中恢復(fù)30 min；

所述預(yù)處理液為含有10% EG和10% DMSO的DPBS溶液，不含鈣鎂；

所述玻璃化冷凍液中含有10μM BAPTA-AM和1μM RR，用EDFSF40液配制；

其中，所述EDFSF40液由EG、DMSO和FSF液按照體積比2﹕2﹕6組成；FSF液為含有30w/v%聚蔗糖70、0.5M蔗糖和20% FBS的DPBS溶液，不含鈣鎂。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、從屠宰場(chǎng)收集牛卵巢，保存于含75μg/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素的35℃生理鹽水中2h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，從直徑為2-8mm的卵泡中抽出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，挑選至少有3層致密卵丘細(xì)胞的復(fù)合體清洗后用于體外成熟，50個(gè)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體為一組置于盛有500μL體外成熟液，且表面覆蓋有礦物油的4孔板中，于38.5℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h，然后用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，收集MII期卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含BAPTA-AM的體外成熟液中在38.5℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中孵育2h；

S2、將卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中孵育30s，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中處理25s，然后裝入OPS管中直接投入液氮中凍存；

S3、解凍時(shí)，將OPS管從液氮中取出，將裝有卵母細(xì)胞的部分迅速置于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中，用吸管將卵母細(xì)胞從OPS管吹出放于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中1min，然后轉(zhuǎn)入38.5℃含0.15M蔗糖的DPBS溶液中5min，進(jìn)行解凍；

S4、解凍后，將卵母細(xì)胞在含RR的體外成熟液中恢復(fù)30 min。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述OPS管為兩端開(kāi)口式塑料管，管壁厚0.02mm，體積0.25mL；所述OPS管的一端被人工拉細(xì)，用來(lái)盛放卵母細(xì)胞，拉細(xì)一端OPS管的頂端外直徑為0.23mm。