[發明專利]一種生產復蘇促進因子的基因工程菌及其應用

在審

• 申請號: 201710193329.8
• 申請日: 2017-03-28
• 公開（公告）號: CN106967660A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 張宇;丁林賢;李明智;梅榮武;王慧榮;李思亮;任旭鋒;蘇曉梅
• 申請（專利權）人: 浙江省環境保護科學設計研究院;浙江師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C07K14/305;C12N1/38;C12N1/20;C12R1/19;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 黃平英

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種生產復蘇促進因子(Resuscitation Promoting Factor,RPF)的基因工程菌和利用該基因工程菌快速制備高純度RPF蛋白的方法，具體涉及重組蛋白的應用。

背景技術

復蘇促進因子(Resuscitation Promoting Factor,RPF)是由俄羅斯Mukamolova課題組發現的一種由Micrococcus luteus在對數生長期后期分泌，在皮摩爾(10^-12mol/L)濃度下就能使處于活的但非可培養(VibleBut non-Culturable,VBNC)狀態的自身菌體重新恢復其生長繁殖能力的蛋白質。RPF除了對自身VBNC菌體有復蘇促進作用外，還可以復蘇與其近緣的處于VBNC時期的革蘭氏陽性菌Mycobacterium屬的部分菌種，與該rpf相似的基因也在鏈霉菌、棒狀桿菌等高GC的革蘭氏陽性菌中存在。Mukamolova等人還報道了RPF采用自分泌或旁分泌的方式分泌信號，不但能使休眠中的VBNC微生物復活，還可以刺激某些細菌的生長，并能調控細胞的繁殖過程。

目前有關RPF的研究主要集中在對人體VBNC菌體(如結核分枝桿菌屬)的復蘇、免疫學及結核病的快速診斷等方面，然而利用RPF對于土壤、水體等環境樣品中處于VBNC狀態的特殊微生物資源發掘國內外還鮮有報道。

發明內容

本發明提供一種利用生物工程技術構建生產重組復蘇促進因子的基因工程菌，應用于土壤、水體等環境樣品中處于VBNC狀態的的微生物的復蘇和分離。

一種生產復蘇促進因子的基因工程菌，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，菌株號為pET28a-RPF(WT)，保藏編號為CGMCC No.13217。

藤黃微球菌(Micrococcus luteus)含有有編碼復蘇促進因子基因(Genbank登錄號CP001628)。本發明將Micrococcus luteus復蘇促進因子基因裝載在pET-28a(+)載體上，轉入到大腸桿菌宿主中，得到一株工程菌。該工程菌已于2016年10月31號保藏于位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13217。其分類命名為：大腸埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli，菌株號為pET28a-RPF(WT)。

所述編碼復蘇促進因子基因rpf的堿基序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明還提供一種如所述基因工程菌在制備高純度重組RPF蛋白中的應用。利用上述工程菌簡單、快速制備高純度的重組RPF蛋白。

重組RPF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明還提供一種所述基因工程菌在復蘇和分離環境樣品中活的但非可培養狀態微生物中的應用。包括如下步驟：將所述基因工程菌表達的重組RPF蛋白分離純化后加入環境樣品培養體系中，培養結束后收集微生物。

進一步地，所述環境樣品為土壤樣品，更進一步地，所述土壤為垃圾填埋場滲濾液均質池周圍土壤樣品。

優選地，所述重組RPF蛋白的添加終濃度為4～6μg/mL；進一步地，終濃度為5μg/mL。

基因工程菌表達重組蛋白的步驟為：將所述基因工程菌在含卡那霉素的LB培養基中培養過夜；次日接種至相同抗性的新鮮培養基中，待菌體生長到OD₆₀₀為0.6～0.8時，加入異丙基硫代β-D-半乳糖苷，降低培養溫度至20～22℃，低轉速培養12-16小時后離心收集菌體，從菌體中分離純化重組RPF蛋白。

本發明是利用工程菌制備的RPF蛋白促進土壤樣品中潛在休眠細菌生長，提高分離豐度，可應用于環境樣品(土壤、水體等)中特殊生理功能微生物類群的發掘和分離。自然界中廣泛存在著活的但不可培養微生物，這些微生物資源通過傳統的微生物分離方法無法獲得，通過添加本發明所涉及重組RPF蛋白，可促發這類微生物生長，應用于某些環境樣品中微生物資源多樣性的發掘。

本發明的工程菌菌株的制備方法及應用過程如下：

(1)以藤黃微球菌的基因組DNA為模板，通過PCR擴增rpf基因；將PCR產物插入到表達質粒pET-28a(+)多克隆位點處，構建重組質粒pET28a-RPF，隨后將重組質粒轉入大腸桿菌獲得基因工程菌。