[發(fā)明專利]一種納米孔單分子傳感器以及制造納米孔陣列的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710191379.2
• 申請(qǐng)日: 2017-03-28
• 公開（公告）號(hào): CN106916737A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王哲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王哲
• 主分類號(hào): C12M1/34
• 分類號(hào): C12M1/34;B82Y15/00;B82Y40/00
• 代理公司: 深圳市嘉宏博知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所44273
• 代理人: 李杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高通量DNA測(cè)序儀的核心元件納米孔的制備，尤其涉及納米孔單分子傳感器以及用該傳感器制造納米孔陣列的方法。

背景技術(shù)

DNA測(cè)序可以揭示人及其它所有物種的遺傳密碼，對(duì)個(gè)性化醫(yī)療有著巨大意義，是人類健康的藍(lán)本。

目前DNA測(cè)序技術(shù)的主流是基于邊合成邊測(cè)序的二代測(cè)序技術(shù)。Illumina公司的bridge amplification高通量測(cè)序技術(shù)為其代表，該測(cè)序技術(shù)通過對(duì)被測(cè)目標(biāo)核酸進(jìn)行平行擴(kuò)增，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，克隆出上百萬(wàn)種固相化單鏈核酸片段模板，進(jìn)行高通量并行序列測(cè)定。第二代測(cè)序技術(shù)存在問題：（1） DNA測(cè)序文庫(kù)制備需要較大量的起始DNA樣本；（2）樣本的平行擴(kuò)增還可能導(dǎo)致測(cè)序文庫(kù)制備的偏性；（3）制備測(cè)序文庫(kù)需要大量的分子生物學(xué)操作，測(cè)序文庫(kù)制備時(shí)間較長(zhǎng)，成本較高；（4）由于單次讀取高度碎片化的片段，后期生物信息學(xué)重組原始序列計(jì)算成本很高。

以PacBio為代表的第三代單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，針對(duì)上述問題作出了重大技術(shù)改革，其特點(diǎn)是：（1）實(shí)現(xiàn)單分子DNA測(cè)序，能夠克服由基因擴(kuò)增引起的測(cè)序偏向性；（2）實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)序，也就是DNA鏈上堿基的閱讀是不間斷的，無需對(duì)測(cè)序?qū)ο筮M(jìn)行高度碎片化，也會(huì)使DNA的讀長(zhǎng)大幅度增加；（3）直接讀出堿基修飾如甲基化等。但測(cè)序成本還很高由于使用熒光標(biāo)記試劑，儀器成本昂貴，通量有待提高。

以納米孔為代表的第四代單分子實(shí)時(shí)電學(xué)測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)具有低儀器和測(cè)序成本的優(yōu)勢(shì)。納米孔測(cè)序方法是單鏈DNA分子在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下穿過納米尺度的微孔，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)過孔離子電流的變化而識(shí)別過孔DNA單鏈上的堿基。制備納米孔的材料可以采用天然的或經(jīng)過改造過的蛋白質(zhì)分子(如α溶血素、MpsA蛋白)，也可以是用微加工制備的固態(tài)納米孔(如氮化硅、二維材料)。以O(shè)xford nanopore公司將生物孔商業(yè)化，推出USB大小納米孔測(cè)序儀。生物孔的厚度在4-5堿基（2-3納米），不能完全實(shí)現(xiàn)單堿基分辨。最近，單層二維固體，如石墨烯，二硫化鉬，氮化硼等由于其單原子級(jí)厚度有望現(xiàn)實(shí)單堿基分辨率。傳統(tǒng)的成孔方法是用高分辨電子顯微鏡的聚焦電子束在固體薄膜上轟擊出單個(gè)納米尺寸的孔。該方法效率低且價(jià)格昂貴，只適合研究用途，不適合商業(yè)化批量生產(chǎn)。作為第四代測(cè)序儀的核心元件，批量生產(chǎn)固體納米孔一直是制約固體納米孔商業(yè)應(yīng)用的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于：克服現(xiàn)有的DNA測(cè)序技術(shù)中制備納米孔只能單孔成孔，效率低，無法滿足高通量要求的缺陷，提供一種納米孔單分子傳感器以及制造納米孔陣列的方法，可以批量制備納米孔，制成納米孔陣列，效率高，滿足高通量要求。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出下列技術(shù)方案：一種納米孔單分子傳感器，其包括固態(tài)支撐膜、固態(tài)薄膜、若干第一電極對(duì)、第二電極對(duì)；

在固態(tài)支撐膜上開設(shè)有若干個(gè)窗口；

固態(tài)薄膜附在固態(tài)支撐膜上；

固態(tài)薄膜的材料是厚度為1納米到3納米的氮化硅或者原子厚度單層二維材料石墨烯、氮化硼或二硫化鉬；

若干第一電極對(duì)安裝在固態(tài)薄膜上位于若干個(gè)窗口附近，第一電極對(duì)包括兩個(gè)分別安裝在固態(tài)薄膜的兩側(cè)而不與該固態(tài)薄膜物理接觸的電極，第一電極對(duì)的材料為銀/氯化銀，或者是鉑；

第二電極對(duì)安裝在固態(tài)薄膜上，第二電極對(duì)包括兩個(gè)安裝在固態(tài)薄膜同一側(cè)的電極，該兩個(gè)電極的材料為惰性金屬銅、汞、鈀、銀、鉑和金以及以上金屬的合金。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出下列技術(shù)方案：一種用所述的納米孔單分子傳感器制造納米孔陣列的方法，包括下列步驟：

步驟1：制備固態(tài)支撐膜；

步驟2：把固態(tài)薄膜附到固態(tài)支撐摸上；

步驟3：把若干第二電極對(duì)安裝到固態(tài)薄膜上；

步驟4：第二電極對(duì)通過外接電路，施加10 mV到1 V電壓于第二電極對(duì)之間；

步驟5：通過若干第一電極對(duì)，施加100 mV到 50 V 的跨膜直流電位，在固態(tài)薄膜上開孔得到納米孔陣列。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列有益效果：

本發(fā)明可以成批量的開設(shè)納米孔，制成納米孔陣列，效率高，能滿足高通量的要求；

本發(fā)明用于DNA測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是多通道平行測(cè)序，純電學(xué)信號(hào)，無需光學(xué)標(biāo)記和擴(kuò)增，長(zhǎng)讀長(zhǎng)，降低序列組裝計(jì)算成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所用的半導(dǎo)體基材的固態(tài)支撐膜及固態(tài)薄膜的示意圖。

圖2為本發(fā)明所用絕緣基材的固態(tài)支撐膜及固態(tài)薄膜的制備過程示意圖。

圖3為開納米孔的示意圖。