[發明專利]用于核酸的合成和/或檢測的組合物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201710189761.X
• 申請日: 2011-06-21
• 公開（公告）號: CN106929506A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: C·特里恩;T·徐;施雅婷;F·N·勒;C·馬約里班克斯
• 申請（專利權）人: 生命技術公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所11038
• 代理人: 李程達

本申請是申請號為201180037906.5的分案申請。

相關申請的交叉參考

本申請要求2010年6月21日提交的美國臨時申請號61/357,031在35U.S.C.119(e)下的優先權的利益，將所述臨時申請通過引用整體并入本文。

背景

本公開內容涉及用于核酸的合成和/或檢測的組合物、試劑盒及方法。

對于許多醫學、診斷和法醫應用，特定DNA序列的擴增是使其能夠在其以極低量存在于其中的樣品中被檢測或使其能夠從所述樣品分離所必需的。最近，特定基因的體外擴增已提供了強大的成本較低的方法以促進利用子生物學技術的治療性蛋白質的生產，并且同樣可用于基因療法。

聚合酶鏈式反應(PCR)技術公開于美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188中。PCR法也描述于Saiki等人,1985,Science 230:1350中。以其最簡單形式，PCR是用于使用兩個寡核苷酸引物酶促合成特定DNA序列的體外方法，所述兩個引物與相反鏈雜交并且側翼連接靶DNA的目標區域。重復系列的反應步驟(包括模板變性、引物退火和通過DNA聚合酶進行的退火引物的延伸)導致其末端由引物的5'末端界定的特定片段的指數積累。PCR能夠選擇性富集特定DNA序列至10⁹倍。

商購可得的PCR預混合物(master mix)提高了效率并且減小了與高通量分析所需的大量PCR反應的裝配相關的錯誤。此類預混合物包含對于所有PCR反應是共同的試劑的組合。例如，預混合物可包含緩沖劑、鹽例如MgCl₂、脫氧核苷三磷酸(dNTP)和熱穩定性DNA聚合酶。每一個孔可包含共同的預混合物以及特定靶核酸和引物對。通常，以濃縮液或凍干粉(當裝配終反應時，所述濃縮液或凍干粉隨后被稀釋或溶解)的形式制備和分配預混合物。

為了進行準確分析，PCR預混合物應當提供可靠的、堅實的和可重現的PCR結果。此外，PCR預混合物應當允許檢測低拷貝靶核酸。PCR預混合物還應當允許進行快速PCR反應循環以允許快速篩選核酸(例如，DNA和cDNA)。此外，PCR預混合物還應當能夠在環境溫度或室溫下在實驗臺上是穩定的，以便PCR反應不必在裝配后立即擴增。

核酸樣品的來源包括但不限于例如衣服、土壤、紙、金屬表面、空氣、水、植物部分以及人和/或動物皮膚、頭發、血液、血清、糞便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液體。此類來源還可包含抑制PCR擴增的化合物。

因此，需要鑒定阻斷或減弱在核酸樣品的來源中發現的組分對PCR擴增的抑制的試劑。

概述

本文中公開了用于通過聚合酶鏈式反應合成和/或檢測核酸的組合物、試劑盒和方法，所述組合物、試劑盒和方法包括DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑。PCR抑制劑阻斷劑減緩由多種通常在包含通過PCR分析的核酸的樣品中發現的化合物引起的PCR的抑制。本文中公開的組合物、試劑盒和方法確保在大范圍靶核酸濃度上的靈敏可靠的PCR結果。組合物還允許在快速PCR熱循環中獲得快速結果。組合物還提供了可在室溫下穩定長達72小時或更長時間的裝配的PCR反應。

本文中公開了包含熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。

本文中還提供了包括含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物的試劑盒，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。

本文中還公開了包括含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑、引物和標記的探針的組合物的試劑盒，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在。

本文中還公開了用于核酸合成的方法，包括將含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑探針的組合物與核酸樣品和引物混合，和使用核酸樣品作為模板合成核酸，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；和使用核酸樣品作為模板合成核酸。在一些實施方案中，合成可在將組合物與核酸樣品和引物混合長達72小時后發生。

本文還公開了用于裝配聚合酶鏈式反應(PCR)的方法，包括向反應容器中添加含有熱穩定性DNA聚合酶和PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中PCR抑制劑阻斷劑以有效地增強裝配的PCR對PCR抑制劑的耐受性的量存在；和向反應容器中添加核酸樣品和引物。