[發明專利]一種診斷骨性關節炎的miRNA分子標志物及一種骨性關節炎檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201710188955.8
• 申請日: 2017-03-27
• 公開（公告）號: CN106947814A
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: 潘曉華;殷春明
• 申請（專利權）人: 深圳市寶安區人民醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/113
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,熊永強

技術領域

本發明涉及生物技術診斷領域，特別是涉及一種診斷骨性關節炎的miRNA 分子標志物及一種骨性關節炎檢測試劑盒。

背景技術

骨關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性關節病變，本病發病率隨年齡的增長而增加，是一種中老年人常見的關節疾病。OA的發病因素眾多，發病機制十分復雜，其中OA特征性的表現是軟骨細胞基質合成不足、關節軟骨退變、骨贅形成和滑膜病變。雖然目前有很多學說通過解釋OA的形成機理，建立了一些診斷和治療OA的方法，但這些診斷OA的手段主要還是以影像學檢查為基礎。目前在臨床影像學輔助檢查(X線、MRI及超聲等)確診OA時，關節軟骨已經出現了不可逆性損傷,這就使得臨床在對OA進行早期干預或治療時沒有一種良好的改變或延緩病情的治療措施。如何早期診斷OA成為延緩及控制骨關節炎進展的關鍵。

MiRNA是廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子RNA，其不編碼蛋白質，但可在轉錄后調控基因表達，影響蛋白質的翻譯，參與機體各種重要的生理和病理過程。隨著科學界對miRNA在調控細胞功能方面的研究日漸加深以及新的 miRNA作用靶標的發現，越來越多的研究證實，miRNA可在多方面調控OA軟骨相關基因的表達。其中，miR-140是在正常軟骨中特異性表達的少數幾個 miRNA之一，敲除小鼠體內的miR-140基因后，小鼠表現出與OA類似的病理過程，表現出軟骨蛋白多糖的減少和關節軟骨的纖維化。關節軟骨的營養來源于滑液的滲透，關節軟骨與關節滑液之間存在一定的物質交換；與血液和尿液相比，關節液成分及量的變化更能反映關節內組織病變的發生和發展。因此，找尋一種miRNA分子標志物，通過檢測關節液中的該分子標志物的表達量來診斷 OA的嚴重程度，可為骨關節炎的早期診斷和治療提供重要依據。

發明內容

鑒于此，本發明提供了一種診斷骨性關節炎的miRNA分子標志物，通過檢測該分子標志物在關節液中的表達量，可獲知骨關節炎病程的進展，從而為骨關節炎的早期診斷和治療提供依據。

具體地，第一方面，本發明提供了一種診斷骨性關節炎的miRNA分子標志物，所述miRNA分子標志物包括miRNA140-3p。

所述miRNA140-3p的序列為：uaccacaggguagaaccacgg。

本發明第一方面提供的miRNA分子標志物為骨關節炎的診斷提供了新的生物標志物，通過檢測關節液中miRNA140-3p的表達量，可初步判斷骨關節液的嚴重程度，靈敏度和特異性高。通過采用本發明的miRNA分子標志物進行骨性關節炎的診斷，具體具有如下優勢：(一)無創：對病人的損傷較小，能夠克服創傷性檢測帶來的風險；(二)穩定：在臨床血清、血漿、關節液樣本中， microRNA以抵抗RNA酶的形式穩定存在；(三)早期：microRNA在疾病早期階段就已經表現出異常，因此可以用于高危人群的預警或者早期檢測；(四) 簡便：采用qPCR進行檢測，操作簡單、靈敏度高、樣本需求量少，檢測周期短，僅需數小時便可獲取結果，價格低廉。

相應地，本發明第二方面提供了一種骨性關節炎檢測試劑盒，包括：

(1)miRNA分子標志物，所述miRNA分子標志物包括miRNA140-3p；

(2)提取RNA試劑：Trizol裂解液、氯仿、SiO₂吸附液、乙醇、DEPC H₂O；

(3)逆轉錄試劑：5×buffer、10mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、 M-MLV逆轉錄酶、RNase inhibitor(RNase抑制劑)、microRNA140-3p逆轉錄引物、內參U6逆轉錄引物、DEPC H₂O；

(4)熒光定量PCR試劑：SYBR Green qPCR SuperMix、microRNA140-3p 特異性前向引物、microRNA140-3p特異性后向通用引物、內參U6擴增引物、 DEPC H₂O。

其中，所述microRNA140-3p特異性前向引物(Forward primer)的基因序列為5’-ACA CTC CAG CTG GGA GGC GGG GCGCCG CGG GA-3’。

所述microRNA140-3p特異性后向引物(Reverse primer)的基因序列為 5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3’。