[發明專利]一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法

在審

• 申請號: 201710188382.9
• 申請日: 2017-03-27
• 公開（公告）號: CN106867944A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 楊超;謝云軍;周文君;李文靜;曹華英;曹景怡;譙曉君;邱林清;韋菁華;鄭建汀
• 申請（專利權）人: 深圳文科園林股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/22;C12R1/38;C12R1/01
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• 代理人: 暫無信息

1.一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法，分離出的分泌1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶菌株(以下簡稱ACC菌株)，為單種或多種混合菌株，其特征在于包括ACC菌株的篩選方法、ACC菌株的評價方法以及對銅尾礦上生長植株促生效應的評價方法。

2.根據權利要求1所述的一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法，其特征在于所述菌株的篩選方法包括：

1)菌株的擴繁和初篩：選用PAF培養基對菌株進行擴繁，用DF培養基對菌株進行分離；將初分后的菌株，在DF培養基上進行二次分離，挑選菌株純化后保存備用；

2)菌株ACC脫氨酶活性的測定：先利用TSB培養基富集培養，然后分離菌種，提取ACC脫氨酶，蛋白質測定采用BioRad蛋白質微量測定法進行測定；

3)菌株IAA分泌能力的測定：先在DF培養液中培養2天，8000g下離心提取上清液，在535nm處測吸光度(OD535)；

4)菌株分泌鐵載體能力測定：在含有鉻天青S以及氯化鐵的LB固體培養基上培養，根據其顯色圈的大小判斷其分泌鐵載體的能力；

5)菌株溶磷能力的測定：純化菌株在Pikovskaya氏培養基上培養7天，觀察溶磷圈大小，比較無機磷溶解能力大小。

3.根據權利要求2所述一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法，其特征在于：所述PAF培養基配方為(1L)：蛋白胨10g，酪蛋白水解物10g，MgSO4 1.5g，K2HPO4 1.5g，甘油10ml，pH值為7.5；所述TSB培養基(1L)：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.5g，K2HPO4 2.5g，pH值為7.5；所述DF培養基配方為：KH2PO4 4g，Na2HPO4·7H2O 11.3g，MgSO4 0.2g，FeSO4 0.01mg，葡萄糖2g，葡萄糖酸2g，檸檬酸2g，(NH4)2SO4 2g，pH值為7.5；所述ADF培養基配方為(1L)：50mmo l/LACC替代DF培養基中的(NH4)2SO4作為唯一氮源；所述Pikovskaya氏培養基為(1L)：酵母提取物0.5g，葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.2g，MgSO4 0.1g，MnSO4 0.0001g，FeSO4 0.0001g，pH值為7.5；所述Salkowski試劑配方為：濃硫酸150ml，蒸餾水250ml，0.5mol/L FeCl3·6H2O 7.5ml(1.35g溶于10ml水中)；所述LB培養基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH值為7.5。

4.根據權利要求1所述的一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法，其特征在于所述多種菌株評價方法包括ACC脫氨酶分泌量、IAA分泌量、鐵載體分泌量以及溶磷能力。

5.根據權利要求1所述的一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法，其特征在于所述的多種促生菌對植株促生效應的評價方法包括：

1)菌株重金屬耐性試驗：在ADF培養基中加入不同量的硫酸銅，將培養皿按照硫酸銅濃度0mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L以及1000mg/L，設置成5個不同梯度；將純化后的菌種分別接種于不同濃度的固體培養基上，測試其生長情況；

2)盆栽試驗：分別選用本土及外來植株進行ACC接種試驗，以未浸染的種子為對照，取銅尾礦表層0-30cm土壤，均勻過篩，滅菌后裝于栽培盆中；將供試植物種子用70％酒精消毒1分鐘，1％次氯酸鈉消毒10分鐘，之后用無菌水洗滌3-5次；將消過毒的植物種子，浸與菌懸液中2-4h，菌懸液為一種菌株或幾種菌株混合，取出播種用，以無菌水的處理作為對照；將處理后的種子播種于尾礦土中，每盆10粒種子，追施有機肥，并在種子發下后2-4天和15-20天追施加菌劑，溫室培養，隔天澆一次水，維持土壤的含水量。60-180天后收獲盆中的植株，分別測量根長、根干重、地上部分長和地上部分干重，以及地上地下部分的重金屬含量分析。