[發明專利]一種解析水稻葉際內生細菌菌群結構的方法

有效

• 申請號: 201710187212.9
• 申請日: 2017-03-27
• 公開（公告）號: CN106967800B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 張莉莉;陳麗瑩
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

1.一種解析水稻葉際內生細菌菌群結構的方法，包括如下步驟：

（a）提取水稻及其葉際內生菌總DNA；

（b）以步驟（a）提取的總DNA為模板，采用引物對1進行第一次PCR擴增，得到PCR產物1；以所述PCR產物1為模板，采用引物對2進行第二次PCR擴增，得到PCR產物2；

所述引物對1由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成；所述引物對2由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成；

（c）對所述PCR產物2進行測序，根據測序結果鑒定菌種，從而解析水稻葉際內生細菌菌群結構。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（a）中，所述提取水稻及其葉際內生菌總DNA的方法包括如下步驟：

（a1）取水稻葉片，去除表面細菌后進行液氮研磨；

（a2）取液氮研磨后樣品，加入TE緩沖液；

（a3）加入SDS和蛋白酶K；

（a4）加入RNA酶，37℃溫浴1-2h；

（a5）加入濃度為5M的NaCl溶液，混勻后再加入CTAB/NaCl溶液，混勻后65℃溫育10min；

所述CTAB/NaCl溶液的溶劑為水，溶質及濃度如下：0.7M NaCl，100g/L CTAB；

（a6）對步驟（a5）所得樣品依次進行DNA抽提、DNA沉淀和DNA溶解，從而獲得所述水稻及其葉際內生菌總DNA。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（a）中，所述TE緩沖液、所述SDS、所述蛋白酶K、所述RNA酶、所述濃度為5M的NaCl溶液和所述CTAB/NaCl溶液的配比為567μl：3mg：0.76U：200μg：100μl：80μl。

4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步驟（b）中，進行所述第一次PCR擴增和所述第二次PCR擴增時，所采用的DNA聚合酶均為高保真KOD Plus。

5.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步驟（b）中，進行所述第一次PCR擴增時，所采用的退火溫度為63℃；進行所述第二次PCR擴增時，所采用的退火溫度為54℃。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟（b）中，進行所述第一次PCR擴增時，所采用的擴增程序為：95℃ 3min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 1min06s，30個循環；72℃，10min；

進行所述第二次PCR擴增時，所采用的擴增程序為：95℃ 3min；95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，30個循環；72℃，10min。

7.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步驟（b）中，進行所述第一次PCR擴增時，設置多個重復。

8.成套引物對：由引物對1和引物對2組成；所述引物對1由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成；所述引物對2由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成。

9.權利要求8所述成套引物對在解析水稻葉際內生細菌菌群結構中的應用。