[發明專利]一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710186175.X
• 申請日: 2017-03-27
• 公開（公告）號: CN106868171B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 任緒義;羅英
• 申請（專利權）人: 溫州迪安醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

本發明公開了一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用，屬于生物檢測技術領域。本發明試劑盒能夠檢測臨床常見的16致病細菌：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌、熒光假單胞菌、鮑曼不動桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、洋蔥克雷伯菌、噬麥芽食單胞菌的16S rRNA，具有特異性高、靈敏度高、污染低及準確、快速檢測的特點，將在臨床微生物的快速鑒定和檢測分析中發揮重要作用，應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及檢測方法。適用于臨床常見致病細菌的菌種鑒定，可以為臨床細菌感染患者合理地進行抗菌藥物治療提供指導。

背景技術

細菌感染是臨床常見的感染性疾病，其發病率和死亡率高，如果得不到早期的診斷和治療，會嚴重危及患者的生命。從臨床樣本中直接分離得到細菌表示感染嚴重需要立即進行抗菌治療。不同的致病菌對藥物種類和濃度的敏感性不同，治療成功的關鍵在于早期應用合適足量的藥物。而傳統的檢測致病菌的方法如顯微鏡檢查、培養法、生物化學檢查和免疫學方法等，由于各種因素的影響，通常需要幾種方法聯合使用，而且耗時也較長，需要1～3d，這期間用藥不當往往使得患者病情加重或增加菌株耐藥性。特別是在多種細菌聯合感染的情況下，更增加了菌種鑒定和用藥的復雜性。因此，建立一種快速且特異性強的微生物檢測方法是十分必要的。

PCR方法是近年來發展起來的診斷技術，這種技術快速、靈敏，在臨床微生物檢測方面獲得了極為廣泛的應用；但是PCR檢測方法也存在一些不足，如檢測每一種病原菌都需要特異性引物，因而每次反應只能確定一種病原菌的有無，這種“一對一”的模式不適合檢測混合感染的復雜標本。臨床微生物的檢測急需建立一種“一對多”的檢測系統，可以通過一次反應檢測多種目標病原體。而通過恒溫擴增-分子信標探針——一種新興的高通量檢測技術，使得通過一次反應對多種病原菌的同時檢測成為可能。

轉錄介導的核酸擴增技術(Transcription mediated amplification，恒溫擴增)是近年來發展起來的一種直接快速檢測RNA的等溫擴增技術，它克服了以往核酸擴增的不足，更為簡便高效，尤其適用于RNA病毒的檢測。與PCR不同，恒溫擴增是在M-MLV、T7RNA聚合酶兩種酶的共同協作下，在41～42℃，由一對引物指導的連續均一的體外特異核苷酸序列等溫擴增酶促反應。其中一條引物其5’端具有被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列。在恒溫擴增基礎上結合分子信標(molecular beacon)探針建立的等溫擴增技術，具有以下優點：⑴等溫擴增：反應在同一恒溫體系條件下進行；⑵快速高效、靈敏度高:該反應時一種無需升降溫的連續快速擴增，也不需RT-PCR反應中第一階段15～30分鐘的反轉錄過程，整個反應時間短、單鏈RNA產物積累迅速，可以在30～60分鐘內完成檢測，一個反應可同時完成對多種臨床常見致病細菌的快速鑒定；并使模板RNA擴增10⁹倍以上，靈敏度甚至可以達到檢測拷貝數為個位的模板RNA。恒溫擴增技術比目前商品化的免疫檢測試劑盒敏感10～1000倍，比常規PCR方法也敏感10～100倍；⑶特異性強：反應不需高溫變性，即使有雙鏈DNA污染也不會被擴增，而通過分子信標探針進行熔解曲線分析進一步提高了檢測的特異性和靈敏度；⑷設計簡單：只需設計1對引物和1條探針來識別靶RNA的3個不同區域。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用，以解決現有技術中臨床常見致病細菌檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易污染出現假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題。

為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：

一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的引物和分子信標探針，包括如下序列：

正向引物F1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；