[發明專利]分泌TRAIL的間充質干細胞及其治療腦瘤的用途

在審

• 申請號: 201710184390.6
• 申請日: 2017-03-24
• 公開（公告）號: CN107287224A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 胡祥;潘偉生;路鋼;徐明愷;劉沐蕓;蘇獻偉
• 申請（專利權）人: 深圳市北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;A61K48/00;A61K38/17;A61K35/28;A61K35/51;A61P35/00
• 代理公司: 北京漢昊知識產權代理事務所(普通合伙)11370
• 代理人: 黃可峻

技術領域

本發明涉及基因重組和干細胞應用領域。具體的，本發明提供了一種可表達分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的構建體，以及包含所述構建體的慢病毒表達載體，以及在其基因組上整合了所述構建體的干細胞，其可表達和分泌所述TRAIL蛋白片段。本發明還提供了所述構建體或載體或干細胞在治療腦瘤或制備腦瘤藥物中的應用。

背景技術

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一員，主要通過與細胞表面的死亡受體(DR4和DR5)結合，啟動外源性凋亡途徑，從而誘導腫瘤細胞產生凋亡。并且，該凋亡誘導活性主要是針對腫瘤細胞，而對正常細胞不產生殺傷作用，因此具有一定腫瘤特異性。獲得TRAIL蛋白最經濟的方式是基因工程表達純化，目前多用的表達系統包括大腸桿菌原核表達系統和細胞真核表達系統。由于TRAIL蛋白是哺乳動物起源，因此真核細胞表達系統具有更好的兼容性。

真核細胞表達TRAIL蛋白過程中有3個問題需要解決。1.TRAIL的可分泌性：一般的真核細胞表達載體缺乏有效的分泌型信號肽序列，不能將表達的目的蛋白輸送到細胞外培養基當中去，而是累積在細胞內部，一方面影響了目的蛋白的積累，另一方面也為后續分離純化過程增加了困難。2.TRAIL蛋白的可溶性：TRAIL蛋白分子的氨基端為疏水區跨膜結構，集中大量疏水氨基酸殘基，導致TRAIL蛋白水溶性很差，在溶液中易集聚成團而失去活性。3.構建的基因工程細胞基因穩定性，普通真核細胞表達載體，將目的基因片段帶入宿主細胞基因組中后，并不能穩定存在，目的基因隨著宿主細胞傳代分裂過程會逐漸丟失，因此需要不斷的抗生素選擇和單克隆細胞篩選。

本領域仍需要獲得能夠穩定和高效表達和分泌有活性的TRAIL蛋白或片段的構建體、載體和宿主細胞。本領域更需要能夠用于治療有關疾病和用于制備相關藥物的能夠穩定和高效表達和分泌有活性的TRAIL蛋白或片段的構建體、載體和宿主細胞。

發明內容

本發明針對以上問題，提供了在其基因組上整合了外源核酸的間充質干細胞，其可穩定和高效表達和分泌TRAIL蛋白片段。為此，本發明還構建了一種可表達分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的慢病毒表達載體，該載體可穩定的轉染哺乳動物宿主細胞，并可將表達的TRAIL蛋白可溶性片段分泌到宿主細胞外的細胞培養液中，便于后續的收集，分離和純化。本發明還提供了所述間充質干細胞在治療TRAIL相關疾病或制備藥物中的應用，這些疾病包括癌癥或腫瘤，特別是腦瘤。

具體的，本發明提供了一種分離的構建體，其中，所述構建體包含(1)分泌信號肽編碼區；(2)TRAIL蛋白三聚體穩定結構編碼區；和(3)TRAIL蛋白片段編碼區，

其中所述TRAIL蛋白片段具有與下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列：

(a)TRAIL的114～281氨基酸殘基的；

(b)與(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更優選地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且具有TRAIL蛋白活性。

真核生物的分泌信號肽存在于待分泌或將成為跨膜部分的蛋白質上，通常位于蛋白質的N-末端。本發明所指的信號肽可以是異源的信號肽，即為非天然地可操作地連接于蛋白質或多肽的信號肽。信號肽的使用可以令目標蛋白質或多肽可分泌到產生其的細胞外或分泌增加。常見的信號肽包括原纖蛋白分泌信號肽、生長因子信號肽、激素信號肽、細胞因子信號肽和免疫蛋白信號肽等。信號肽的例子包括GDF信號肽、IGF信號肽、BMP信號肽、神經營養因子信號肽、PDGF信號肽和EGF信號肽、激素信號肽(例如生產激素、胰島素、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH)、或白細胞介素信號肽。這些信號肽多來自哺乳動物來源的，例如人、小鼠、大鼠、豬、猴等，優選的，本發明使用的信號肽是小鼠或人來源的。所述信號肽還可經過修飾，以增強其幫助蛋白質分泌的能力。

其中本發明的構建體中采用的所述分泌信號肽可選自人原纖維蛋白分泌信號肽，人生長激素分泌信號肽，人免疫球蛋白信號肽，人白細胞介素2信號肽等。