[發明專利]一種雞傳染性喉氣管炎病毒的實時熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201710184165.2
• 申請日: 2017-03-24
• 公開（公告）號: CN107099617A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 張鐵;陳諫;王春光;孟凡國;張廣群;蔣桂娥;賈書芬;賈澤;張石磊
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 石家莊國為知識產權事務所13120
• 代理人: 申超平

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種雞傳染性喉氣管炎病毒的檢測方法。

背景技術

傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）是皰疹病毒科的一個成員。本病主要侵害家禽，可引起雞傳染性喉氣管炎(AILT)是一種急性、接觸性上部呼吸道傳染病。其特征是呼吸困難、咳嗽和咳出含有血樣的滲出物。剖檢時可見喉部、氣管粘膜腫脹、出血和糜爛。病死率在20%以上。本病1925年在美國首次報道后，現已遍及世界許多養雞地區。本病傳播快，死亡率較高，在我國較多地區發生和流行，危害養雞業的發展。目前尚無有效的治療藥物，主要依靠疫苗進行免疫預防。

目前，在流行病學監測和致病機理研究中，對傳染性喉氣管炎病毒基因診斷方法經常使用的是傳統PCR方法，其特異性不強，易出現假陽性，操作繁瑣，易產生PCR污染問題，只能對反應的終產物進行半定量或定性分析，且結果必須通過下一步的電泳進行條帶分析得到。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種雞傳染性喉氣管炎病毒的實時熒光定量PCR檢測方法，解決傳統PCR方法特異性不強，易出現假陽性，操作繁瑣，易產生PCR污染，只能對反應的終產物進行半定量或定性分析的問題，具有特異性強，靈敏度高，操作簡單快速，不易出現假陽性，不易產生PCR污染，對PCR進程進行實時檢測，對每一個循環進行定量和定性分析，分析結果可以直接通過計算機讀出的特點。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

一種雞傳染性喉氣管炎病毒的實時熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：

（1）引物設計：針對雞傳染性喉氣管炎病毒的gB基因設計并合成了一對引物PF和PR，上游引物PF為5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′，下游引物PR為5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′；

（2）傳統PCR擴增：首先對提取出對雞傳染性喉氣管炎病毒DNA進行傳統PCR擴增，通過預變性、變性、退火、延伸步驟，快速特異地在體外擴增出目的DNA片段；

（3）陽性標準品制作：將目的DNA片段連接入載體，轉入感受態細胞，構建重組質粒作為陽性標準品；

（4）熒光定量PCR檢測：用梯度稀釋的質粒標準品進行real-time PCR擴增，得到擴增曲線，并以拷貝數為x軸，以Ct值為y軸，構建real-time PCR標準曲線，建立檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的熒光定量PCR方法；

（5）對該引物進行了特異性和靈敏度檢測。

傳統PCR檢測結果顯示，引物特異性良好，ILTV的DNA 有擴增條帶，大小為116bp，陰性對照ddH₂O未檢測到擴增條帶；real-time PCR 檢測結果同樣表明引物特異性，該對引物對ILTV只有唯一的產物吸收峰。

進一步地，步驟（3）中所述陽性標準品制作的步驟為：將PCR產物與pUC19-T載體25℃條件下連接，轉化于DH5α感受態細胞中，37℃過夜培養，挑取單菌落，轉于含有Amp的LB液體培養基中，37℃環境下，以200 r/min振蕩培養12h，提取重組質粒，測序，用微量紫外可見分光光度計測定濃度和純度，根據摩爾定律，計算出單位體積質粒所含的DNA拷貝數濃度，依據計算出的拷貝數進行10倍梯度稀釋，作為標準品。

進一步地，步驟（4）中所述熒光定量PCR檢測的步驟為：用10倍梯度稀釋的質粒標準品進行real-time PCR擴增 ，得到擴增曲線，并以拷貝數為x軸，以Ct值為y軸，構建real-time PCR標準曲線，建立檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的熒光定量PCR方法。

進一步地，步驟（1）中所述gB基因Gen Bank登錄號為EU104985。

進一步地，步驟（2）中所述傳統PCR擴增的20μL的反應體系為：2×mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH₂O 7μL。

進一步地，步驟（2）中所述反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，循環30次；最后72℃延伸5 min。

進一步地，步驟（3）中所述振蕩培養的條件為37℃環境下，以200 r/min振蕩培養12h。