[發明專利]一種用于無創產前檢測的文庫構建方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201710183553.9
• 申請日: 2017-03-24
• 公開（公告）號: CN108085315A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 張艷艷;江媛;李巧玲;魏漢敏;趙霞;董超;沈寒婕;田凱;于競;傅書錦;蘇小珊;耿春雨
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B40/06;C40B50/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了一種用于無創產前檢測的文庫構建方法及試劑盒。本發明的方法包括：在同一反應體系中，在dNTP和額外dATP存在下，利用聚合酶、多聚核苷酸激酶和不具有3’?5’外切活性的聚合酶對片段化DNA進行末端修復與加A；然后進行加接頭以及純化、PCR和環化。本發明的方法，大大縮短建庫時間，提升高通量建庫技術應用到無創產前檢測等醫學臨床檢測項目的實效，并且降低起始DNA在建庫過程的損耗，降低PCR擴增的循環數，從而提高可用數據比率，降低數據堿基偏向性，并且能實現無需PCR的建庫。可以廣泛實現不同類型微量起始DNA的快速建庫，并且可以應用于BGISEQ、illumina等多種測序平臺。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及文庫構建技術領域，特別涉及一種用于無創產前檢測的文庫構建方法及試劑盒。

背景技術

目前，高通量測序技術已廣泛應用到醫學研究和檢測領域，如無創產前檢測(NIPT)，有限的樣本量和檢測報告輸出的時效性對該技術提出了更高的要求。簡化文庫構建流程、提高低起始量樣本的建庫成功率勢在必行。通過優化和改進文庫構建方法，縮短酶反應時間和建庫步驟、提高樣本轉化成文庫的效率成為高通量測序技術拓展應用領域的一大關鍵點。

經典的高通量文庫構建步驟包括：1.基因組打斷(包括物理打斷法和化學打斷法，如covaris超聲打斷、fragmentase酶切打斷)；2.雙鏈DNA(Deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸)末端修復；3.3’末端加dATP(deoxyadenosine triphosphate,三磷酸脫氧腺苷)；4.加與測序平臺匹配的接頭；5.PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)擴增。每個步驟都需要進行純化反應，有時還需要在酶反應之后進行一次片段選擇(步驟1、4、5其中之一)，整個流程需要大概8-9個小時才能完成。

為簡化流程，一些生物公司推出了新的建庫技術，如illumina公司提出了基于轉座酶的打斷與加接頭一步完成的快速建庫方法，但該方法存在明顯的測序數據堿基偏向性問題，且無法應用到血漿游離DNA這類不需要打斷的樣本。此外，illumina和BiooScientific等公司提出了無需PCR(PCR-free)的方法，節省PCR擴增步驟，但對樣品的起始量要求較高(500ng-2μg)。

發明內容

本發明提供一種用于無創產前檢測的文庫構建方法，該方法能夠在同一個反應體系中實現DNA末端修復與加A反應，并且接著進行接頭連接和純化處理，簡化酶反應和純化步驟，提高起始DNA轉化成可連接接頭DNA的效率，降低對起始DNA總量的要求，也可降低PCR擴增的循環數和提高低起始量DNA實現無需PCR的建庫，可以提高上機文庫的可用數據比率并且降低數據堿基偏向性，本發明的方法適用于不同類型微量起始DNA的快速建庫。本發明還提供一種用于無創產前檢測的文庫構建試劑盒，以及構建得到的可以用于無創產前檢測的文庫。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種用于無創產前檢測的文庫構建方法，該方法包括：

在同一反應體系中，在dNTP存在下，利用聚合酶將片段化DNA的末端補平或切平，例如利用聚合酶的5’-3’聚合活性將5’突出末端補平和/或聚合酶的3’-5’外切活性將3’突出末端切平，利用多聚核苷酸激酶將5’羥基轉變成5’磷酸基團且將3’磷酸基團轉變成3’羥基；在過量dATP存在下，利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在雙鏈DNA 3’末端加上dATP；

在上述反應體系中，直接加入鼓泡型接頭和連接反應混合液，使上一步產生的3’A突出的雙鏈DNA與上述接頭連接；

純化上一步接頭連接的產物后，加入與上述接頭序列兩端互補的核酸單鏈作為引物進行PCR擴增，其中一條引物5’末端有磷酸化修飾，得到大量雙鏈DNA，其中一條鏈的5’端有磷酸基團；