[發(fā)明專利]一種基于數(shù)字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710183073.2
• 申請日: 2017-03-24
• 公開（公告）號: CN106916893A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛紅菊;武振華;趙建龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所31233
• 代理人: 黃志達(dá),魏峯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因甲基化檢測領(lǐng)域，特別涉及一種基于數(shù)字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法。

背景技術(shù)

DNA甲基化主要是指胞嘧啶(C)5位碳的甲基化，形成^m5C。哺乳動(dòng)物DNA中，呈甲基化狀態(tài)的堿基對^m5CG會對基因的表達(dá)起到限制作用。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化與惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。DNA甲基化水平在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的改變主要表現(xiàn)為局部高甲基化和基因組的低甲基化。首先是抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)，在正常細(xì)胞中該區(qū)域處于低甲基化或者未甲基化狀態(tài)，基因可以正常表達(dá)，從而不斷的抑制腫瘤發(fā)生。而在癌細(xì)胞中，基因的啟動(dòng)子區(qū)域會呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài)，抑制了基因的表達(dá)，并最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。其次是對于在正常細(xì)胞中處于高度甲基化的一些基因和重復(fù)序列，其甲基化水平降低將造成這些基因的激活，細(xì)胞過度增殖，并最終導(dǎo)致癌癥。

傳統(tǒng)甲基化檢測方法中，基于測序的方法雖然檢測結(jié)果往往被視為金標(biāo)準(zhǔn)，但其過分依賴于昂貴的儀器和復(fù)雜的操作過程，且無法檢測出微量甲基化拷貝。而另一些方法，例如甲基化特異性高分辨率溶解曲線法，熒光定量PCR法等，雖然簡便快捷，但檢測結(jié)果不夠精確，靈敏度不夠高。以上這些缺點(diǎn)都限制了上述檢測手段在實(shí)際臨床檢測中的應(yīng)用價(jià)值。

數(shù)字PCR芯片技術(shù)，作為一種能夠精確檢測到單個(gè)DNA分子的技術(shù)，具有很多優(yōu)點(diǎn)。例如：

一、能夠?qū)ζ鹗紭悠愤M(jìn)行絕對定量，而不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)品，不需要預(yù)先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、靈敏度高，檢測限能夠達(dá)到10¹數(shù)量級個(gè)拷貝。

三、可以精確定量小拷貝數(shù)變化，準(zhǔn)確識別DNA分子的微小濃度差異。

這些優(yōu)點(diǎn)都使得數(shù)字PCR芯片具有比傳統(tǒng)定量方法更優(yōu)越的性能，從而更加適用于生化檢測。

甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶，是一類能夠特異性識別其切割位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的限制性內(nèi)切酶，當(dāng)其切割位點(diǎn)狀態(tài)為甲基化時(shí)，切割不發(fā)生。當(dāng)其切割位點(diǎn)狀態(tài)為非甲基化時(shí)，切割發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于數(shù)字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，該方法實(shí)現(xiàn)了對基因甲基化程度絕對定量的方法，該方法能夠準(zhǔn)確的定量出待檢測基因的甲基化拷貝數(shù)所占的百分比；檢測靈敏度高；檢測過程簡單；且檢測時(shí)間短。

本發(fā)明的一種基于數(shù)字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，包括：

(1)針對待檢測的目的基因，確定富含甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的區(qū)域，并對該區(qū)域設(shè)計(jì)引物與taqman探針；

(2)將待檢測樣本分成兩份，其中一份經(jīng)甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理，另一份不處理；

(3)利用數(shù)字PCR芯片分別對兩份樣本進(jìn)行定量檢測，最終計(jì)算出樣本中目的基因的甲基化程度。

所述步驟(1)中的taqman探針兩端分別修飾FAM熒光分子和BHQ熒光淬滅劑分子。

所述步驟(3)中的數(shù)字PCR芯片為采用PDMS制作的陣列式數(shù)字PCR微流體芯片。

采用PDMS制作的陣列式數(shù)字PCR微流體芯片不依賴專用的數(shù)字PCR設(shè)備，分液和讀取均在芯片上完成，大大降低了甲基化的數(shù)字PCR檢測成本。

所述步驟(3)中的PCR芯片反應(yīng)體系為：10μL羅氏480probs master mix，0.5μL濃度為10μM前引物與后引物，0.5uL濃度為10μM的taqman探針，并加水至總體積為20μL。

所述步驟(3)中的計(jì)算方法為：統(tǒng)計(jì)兩份樣本中的拷貝數(shù)，從未經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果得到甲基化與非甲基化等位基因總數(shù)，從經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果得到樣本中的甲基化拷貝數(shù)，兩者相除，最終得到樣本中甲基化等位基因的百分比，即樣本的甲基化程度。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體為：

第一步：欲檢測的目的基因?qū)ふ业礁缓谆舾行韵拗菩詢?nèi)切酶切割位點(diǎn)的區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物與taqman探針。首先，確定要研究的目的基因相應(yīng)的區(qū)域，在該區(qū)域中找到富含甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的序列，以該序列為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并同時(shí)設(shè)計(jì)出相應(yīng)的taqman探針。

第二步：對樣本進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理。待檢測樣本為從細(xì)胞，組織，血液等中提取的DNA，將待檢測樣本均分為相等的兩份：A部分與B部分。B部分中按照相應(yīng)的甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶的使用說明，將B部分樣本進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，B部分樣本中的非甲基化拷貝將被限制性內(nèi)切酶切割消化，只剩下甲基化拷貝。A部分不使用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理。兩部分樣本在進(jìn)行完上述步驟后保存待用。