[發明專利]利用SH4

有效

• 申請號: 201710179407.9
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN107090469B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 盧寶榮;晏煥新;蔡星星
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.一種利用SH4基因沉默元件降低栽培稻以及栽培稻與雜草稻雜交后代種子落粒性的方法，其特征在于，利用基因沉默技術使栽培稻中落粒基因SH4功能喪失，沉默的SH4基因通過雜交漸滲進入雜草稻群體，可以降低栽培稻與雜草稻雜交后代群體的種子落粒性，具體步驟為：

（1）合成SH4基因沉默元件；

（2）將能夠驅動SH4基因沉默元件在栽培稻離層組織中高效表達的植物表達啟動子，與所述SH4基因沉默元件進行融合，形成嵌合基因；

（3）利用植物表達載體，將所述嵌合基因通過轉基因方法導入栽培稻得到轉基因栽培稻品系；

（4）模擬栽培稻基因向雜草稻漂移的過程，將所述轉基因栽培稻品系與雜草稻進行人工雜交，得到雜交F₁代群體，雜交F₁代群體通過自交繁殖得到雜交F₂代群體；通過對雜交F₁代群體和雜交F₂代群體進行轉基因成分鑒定，將其分為含有SH4基因沉默元件的轉基因群體F₁₊，F₂₊和不含轉基因的群體F_1-，F_2-；對雜交F₁代群體和雜交F₂代群體進行田間種植，在植株成熟期測量并計算種子落粒性SHI；當含有SH4基因沉默元件的轉基因群體的SHI值比不含轉基因的群體的SHI值低，即表明SH4基因沉默元件降低了栽培稻與雜草稻雜交后代的種子落粒性；

步驟（1）中合成SH4基因沉默元件中的沉默元件有兩種類型，分別為：

（1）人工microRNA基因沉默元件，其合成方法為，含有與編碼栽培稻SH4基因的cDNA核苷酸序列中的連續21個核苷酸序列差異不超過2個堿基的核苷酸序列和與其互補的核苷酸序列，并替換栽培稻內源基因osaMIR528中相應的基因沉默核苷酸序列，能夠在植物體內形成雙鏈RNA分子；

（2）具有發夾結構的RNA干擾基因沉默元件，其合成方法為，含有與編碼栽培稻SH4基因的cDNA核苷酸序列具有100至300個連續核苷酸序列和與其互補的核苷酸序列，并被植物表達載體pTCK303中的內含子間隔，能夠在植物體內形成雙鏈RNA分子；

步驟（4）中所述測量種子落粒性的方法為：在所述轉基因栽培稻與雜草稻雜交后代植株的成熟期隨機選取3-5個植株，再于每個植株上隨機選取10-20粒充分成熟且飽滿的種子，使用數字顯示拉力計逐一測量這些種子在脫落過程中所需承受的最大拉力BTS，單位為克力；計算所有種子落粒所需承受拉力值的平均數BTS_ave，并利用如下數學模型公式計算種子落粒性指數SHI，其單位為百分比：

。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）所述的植物表達啟動子，包括組成型強表達的啟動子，或者離層組織特異性表達的啟動子；其中，組成型強表達的啟動子選用來自玉米泛素基因的啟動子Ubi，離層組織特異性表達的啟動子選用來自栽培稻落粒基因SH4的啟動子pSH4。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）所述的植物表達載體為pCXUN、pCXUN-osaMIR528、pCAMBIA1301或pTCK303。