[發明專利]一種馬立克氏病毒的懸浮培養方法

在審

• 申請號: 201710179331.X
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN107058243A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 溫良海;李延鵬;陳瑞愛;趙兵;羅瓊
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;肇慶大華農生物藥品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙)44288
• 代理人: 趙賽,袁嘉恩

1.一種馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于包括以下步驟：

1)雞胚源DF-1細胞系的傳代與培養：以雞胚源DF-1細胞系作為制備病毒用細胞；將雞胚源DF-1細胞經胰酶-EDTA細胞分散液消化成單個均勻細胞，然后置于細胞生長液繼續培養，當細胞長成單層時，用于繼續傳代或接種病毒；

2)細胞毒種的繁殖：用稀釋液將馬立克氏病毒種稀釋，將病毒和經步驟1)處理的DF-1細胞一起接入含細胞培養液的培養瓶中進行培養，當細胞病變時收獲細胞毒作為毒種；

3)制苗用病毒的吸附培養：將從步驟2)得到的毒種稀釋為病毒液，將病毒和新的雞胚源DF-1細胞一起接入含有微載體和懸浮培養液的培養瓶中，進行懸浮吸附培養；

4)病毒的增殖培養及收獲：棄去懸浮培養液，加入病毒增殖培養液進行懸浮增殖培養；當接入的細胞病變率達80％以上時，收獲病毒液并保存。

2.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，所述馬立克氏病毒為馬立克氏病血清Ⅰ型CVI988/Rispens株、814株、血清Ⅱ型SB-1株、血清Ⅲ型火雞皰疹病毒Fc-126株中的至少一種。

3.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟2)中，接種病毒的感染復數為0.001-1。

4.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟3)中，所述懸浮培養液為含體積百分比5-10％新生牛血清的DMEM/F12培養基。

5.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟3)中，所述培養瓶中的微載體和細胞的個數之比為1:50～250。

6.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟3)中，所述微載體的濃度為1-5g/L。

7.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟3)中，所述懸浮吸附培養的時間為12-48h；培養溫度為36～38℃。

8.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟4)中，所述的病毒增殖培養液為含體積百分比2％新生牛血清的DMEM/F12培養基。

9.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟4)中，所述懸浮增殖培養的時間為24-72h；培養溫度為36～38℃。

10.如權利要求1所述的馬立克氏病毒的懸浮培養方法，其特征在于，步驟3)和步驟4)中，在培養的過程中對培養液進行攪拌；攪拌的方式為間歇攪拌或連續攪拌；攪拌速度為20-50RPM。