[發明專利]一種淀粉酶突變體制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201710176535.8
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN107201351B
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發明（設計）人: 姚斌;羅會穎;張多多;涂濤;王苑;黃火清;蘇小運;柏映國;王亞茹
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/30
• 分類號: C12N9/30;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 11737 北京法信智言知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 劉靜榮

一種高比活、高催化效率淀粉酶變體及其制備方法和應用，涉及基因工程和遺傳工程領域。本發明以來源于Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性淀粉酶為母本，采用分子生物學技術將野生型進行了定點突變。在此改造條件下，淀粉酶突變體比母本野生型(突變前)的催化效率及比活性有顯著提高。利用此策略可以大大提高淀粉酶的比活及作用條件，為其在工業生產領域提供了基礎。此策略對淀粉酶及其它酶的催化效率和比活提高具有重要的指導意義。

技術領域

本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體地，本發明涉及一種淀粉酶突變體制備方法及其應用。

背景技術

淀粉酶是一種用途極為廣泛的生物催化劑，可應用于面包制作業、淀粉的糖化和液化、紡織品脫漿、造紙、清潔劑工業、化學、臨床醫學的分析和制藥業等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶為內切酶，以無規則的方式切開淀粉分子內部的α-1，4糖苷鍵，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一種鈣離子依賴性酶。β-淀粉酶從非還原性末端順次切下麥芽糖，為外切酶。葡萄糖淀粉酶是一種作用于α-1，4糖苷鍵的外切酶，從非還原糖末端切下葡萄糖分子。

淀粉水解酶是淀粉制糖工業的重要用酶。根據其在淀粉制糖工業中的應用可分為液化酶和糖化酶，而葡萄糖淀粉酶和麥芽三糖淀粉酶是重要的糖化酶。麥芽三糖淀粉酶可以催化降解淀粉生成高濃度的麥芽三糖。麥芽三糖作為一種優勢特別明顯的麥芽寡糖，被廣泛地應用于焙烤、運動飲料和醫藥行業，受到越來越多的青睞。本研究挖掘新型的嗜酸麥芽三糖淀粉酶，為淀粉制糖工業提供性質優良的淀粉水解酶。

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)屬于糖苷水解酶13家族，能夠作用于可溶性淀粉、糖元、直鏈淀粉等α-1,4-葡聚糖，其水解淀粉的主要產物是一些由葡萄糖單位組成的低聚糖和糊精的混合物。α-淀粉酶廣泛應用于食品、紡織和制藥等工業。真菌α-淀粉酶主要來源于青霉屬和曲霉屬，但是自身的活性低,并達不到工業需求，而淀粉酶的異源表達還是個難題尤其是進行畢赤酵母異源表達，本文是從青霉屬T.leycettanus JCM12802獲得的淀粉酶基因截掉CBM20作為野生型后進行異源表達，通過定點突變獲得高比活菌株。

高比活、高催化效率的淀粉酶工程菌株的獲得主要通過誘變、篩選和酶分子改良獲得。誘變分為自然突變和人工誘變，自然突變成功的幾率非常小，人工誘變的工作量較大且有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質難以控制。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。酶分子改良目的性強，針對酶分子具體結構分析進行改造，從而達到提高比活力和催化效率的目的。

發明內容

本發明提供了一種淀粉酶突變體的制備方法，是將野生型淀粉酶的87位的谷氨酸突變成賴氨酸。

本發明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述突變體基因的重組菌株。

上述野生型淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明所保護的淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述野生型淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明所保護的淀粉酶突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明還是提供一種制備所述淀粉酶突變體的方法，其技術方案如下：

(1)將基因amy6插入質粒中，獲得包含基因amy6的重組質粒，質粒優選pPIC9；

(2)采用北京全式金公司的Fast Mutagenesis System對上述重組質粒進行特異性點突變擴增獲得突變體質粒；