[發(fā)明專利]一種芫花莖段外植體初代組織培養(yǎng)基

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710176227.5
• 申請(qǐng)日: 2017-03-23
• 公開（公告）號(hào): CN107041303A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張虎;許建民;潘靜霞;宋微
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204
• 代理人: 許丹丹

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物初代組織培養(yǎng)，具體涉及一種芫花莖段外植體初代組織培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

芫花(Daphne genkwa Sieb.et Zucc.)為瑞香科瑞香屬落葉灌木，其花朵錦簇、花色艷麗，具有較高的觀賞價(jià)值，為我國(guó)優(yōu)良野生花卉資源。同時(shí)也是我國(guó)重要的中藥材和生物農(nóng)藥。

從20世紀(jì)60年代開始，尤其是90年代以后，芫花的生境遭到嚴(yán)重破壞，種群分布范圍縮小，居群數(shù)量及個(gè)體數(shù)量急劇下降，其野生可利用資源逐漸減少。研究芫花的繁殖技術(shù)成為保護(hù)和利用該植物資源的迫切要求。

芫花一般采用播種方法進(jìn)行繁殖，但種子繁殖其后代性狀發(fā)生分離，無法保持母本植株的優(yōu)良性狀。芫花的扦插繁殖，生根成活率低，加之穗源少，繁殖效率低，不能實(shí)現(xiàn)快速大量繁殖。采用組織培養(yǎng)方法繁殖芫花，可保持母本優(yōu)良性狀，為優(yōu)良單株的快速擴(kuò)繁提供途徑。

目前，關(guān)于芫花的研究主要集中在其化學(xué)組分及藥理作用，以及生物農(nóng)藥的研究上，在繁殖、栽培技術(shù)的相關(guān)研究較少，其莖段外植體組織培養(yǎng)快繁技術(shù)在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種芫花莖段外植體初代組織培養(yǎng)培養(yǎng)基，使用該初代組織培養(yǎng)基對(duì)芫花莖段外植體進(jìn)行初代組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)其叢生芽，可以簡(jiǎn)單、快捷的獲得芫花組培苗，培養(yǎng)周期明顯縮短，培養(yǎng)成功率明顯提高，并且萌芽率高，玻璃化率低。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，如本發(fā)明所述一種芫花莖段初代組織培養(yǎng)基，包括如下組分：MS+0.1mg·L^-1NAA+1.0-1.5mg·L^-1ZT，加入蔗糖25-30g/L、瓊脂6.5-7g/L，調(diào)整酸堿度至pH＝5.7-5.8。

進(jìn)一步地，所述的初代組織培養(yǎng)基，包括如下組分：MS+0.1mg·L^-1NAA+1.5mg·L^-1ZT，加入蔗糖30g/L、瓊脂7g/L，調(diào)整酸堿度至pH＝5.8。

所述初代組織培養(yǎng)基用于芫花莖段外植體的初代組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)芫花外植體的選?。翰杉L(zhǎng)健壯，腋芽飽滿，無病蟲害的芫花當(dāng)年生枝條，去除全部葉片，剪截成8～10cm帶腋芽莖段作為外植體；

(2)芫花外植體的處理：將外植體用洗衣粉溶液浸泡洗滌15～20min，接著用流水沖洗8～12小時(shí)。在無菌環(huán)境下將外植體剪成4-5cm莖段進(jìn)行消毒處理；消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成1.5～2.5cm的長(zhǎng)度，接入芫花莖段外植體初代組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中；

(3)芫花外植體的培養(yǎng)：將步驟(2)接入初代培養(yǎng)基中的外植體置于培養(yǎng)室的培養(yǎng)架進(jìn)行光照培養(yǎng)，直至誘導(dǎo)叢生芽萌發(fā)。

其中，步驟(2)所述洗衣粉溶液(洗衣粉為市售的普通洗衣粉)質(zhì)量體積比為0.2-0.5％，浸泡時(shí)間為15～20min，接著用流水沖洗8～12h。通常洗衣粉溶液浸泡時(shí)間為20min，流水沖洗時(shí)間為12h。芫花莖干表面密被短絨毛，直接進(jìn)行消毒處理殺菌效果不理想。洗衣粉溶液可有效去除粘黏在茸毛上的污物，改善消毒效果；流水沖洗可進(jìn)一步洗凈粘黏在植物體表或絨毛上的污物，改善消毒效果。

步驟(2)所述消毒為先采用體積百分比濃度為70～75％乙醇溶液進(jìn)行消毒，再將莖段放入1g·L^-1升汞加3-5滴吐溫80的混合溶液浸泡消毒。

進(jìn)一步地，所述乙醇進(jìn)行消毒的時(shí)間為30-45s，升汞加吐溫80混合溶液的浸泡消毒時(shí)間為10～14min。吐溫80為表面活性劑，可以濕潤(rùn)外植體表面組織，促進(jìn)殺菌劑充分接觸外植體表面組織，達(dá)到較好的消毒效果。

其中，步驟(3)所述光照培養(yǎng)的溫度22～25℃，光照強(qiáng)度2000～3000lx，相對(duì)濕度70-75％，光周期14h晝/10h夜。

步驟(3)所述光照培養(yǎng)的時(shí)間25-30d。

本發(fā)明所用的培養(yǎng)基和試劑都由市售可得。

本發(fā)明所用外植體為芫花當(dāng)年生枝條，去除葉片，剪截成帶腋芽莖段其優(yōu)勢(shì)在于：1.莖段外植體個(gè)體較大，消毒、清洗、剪切等試驗(yàn)操作方便易行；2.莖段外植體對(duì)消毒試劑具有較強(qiáng)耐受能力，消毒致死率低，較其他方法更易獲得無菌試管苗。3.使用莖段外植體誘導(dǎo)叢生芽與愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽的方法相比，其誘導(dǎo)叢生芽的萌發(fā)僅需打破腋芽休眠，而無須經(jīng)歷脫分化與再分化過程，因而成功率較高，其培養(yǎng)周期也明顯縮短。