[發(fā)明專(zhuān)利]與豌豆抗白粉病等位基因er1?9共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710175612.8
• 申請(qǐng)日: 2017-03-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058306A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱振東;孫素麗;鄧東;段燦星
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記位于豌豆遺傳圖譜第VI連鎖群上，與er1-9的遺傳距離為0cM，用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的3條特異性引物具有如下核苷酸序列：

正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC

正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT

通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA。

2.用于擴(kuò)增與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記的引物組合，其特征在于，其含有：

正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC

正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT

通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA。

3.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記或權(quán)利要求2所述的引物組合在豌豆抗白粉病的分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。

4.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記或權(quán)利要求2所述的引物組合在鑒定豌豆抗白粉病種質(zhì)資源中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR擴(kuò)增待測(cè)豌豆的基因組DNA，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為75bp時(shí)，待測(cè)豌豆為含有er1-9的抗白粉病豌豆；當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為79bp時(shí)，待測(cè)豌豆為不含有er1-9的抗白粉病或感白粉病豌豆。

6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測(cè)豌豆的基因組DNA；

2)以待測(cè)豌豆的基因組DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；所述特異性引物為：

FAM正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC

HEX正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT

COM通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA；

3)利用KASP分析技術(shù)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以5μl計(jì)為：10ng/μl豌豆基因組DNA 2.0μl，KASP Master Mix 2.5μl，混合引物0.07μl，ddH₂O 0.43μl。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃熱激活15分鐘；95℃變性20秒，65-55℃退火和延伸25秒，10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降低1.0℃；95℃變性10秒，56℃退火和延伸60秒，30個(gè)循環(huán)。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟3)中利用KASP分析技術(shù)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用LGC系統(tǒng)的SNPline平臺(tái)進(jìn)行SNP基因型分型檢測(cè)。所有含有等位基因er1-9的豌豆資源均出現(xiàn)在紅色散點(diǎn)區(qū)域，該基因具有FAM標(biāo)簽序列；而不含有等位基因er1-9的抗白粉病和感白粉病豌豆資源均出現(xiàn)在藍(lán)色散點(diǎn)區(qū)域，該基因具有HEX標(biāo)簽序列；抗感親本雜交獲得的群體中的雜合株系均出現(xiàn)在綠色散點(diǎn)區(qū)域，該基因具有FAM和HEX兩種標(biāo)簽序列。

10.用于檢測(cè)抗白粉病豌豆資源的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有權(quán)利要求2所述的特異性引物組合。