[發明專利]一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒

在審

• 申請號: 201710173792.6
• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN106834513A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 魏敏杰;張晶;吳慧哲;陳秋晨
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 沈陽世紀藍海專利事務所(普通合伙)21232
• 代理人: 侯志奇

1.一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒，用于對總RNA中的某一種微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量檢測，其特征在于：所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒包含的一種具有“由多功能莖環結構維持的單側3’懸端雙螺旋結構”的探針和一種含DNA鏈置換酶的雜交緩沖液。

2.根據權利要求1所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒，其特征在于：所述的一種具有“由多功能莖環結構維持的單側3’懸端雙螺旋結構”的探針由A、B鏈兩條長度不同的寡核苷酸單鏈組裝而成，A鏈較長，B鏈較短，其中A鏈核苷酸序列為SEQ ID NO.1：5’ ROX-CTCGGCATACCTATAGATACAAGCTTGCCGAGT-(BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGT-3’， 序列中的ROX為熒光基團，BHQ2為淬滅基團；B鏈核苷酸序列為SEQ ID NO.2：5’GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAGAC-3’。

3.根據權利要求1所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒，其特征在于：所述的一種含DNA鏈置換酶的雜交緩沖液，雜交溫度在55-65 ℃之間，由Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase 32 U、MgSO₄ 10 mM、dNTP Mix 1 mM/種、Tris-HCl 20 mM、(NH₄)₂SO₄ 10 mM、KCl 50 mM組成，其中MgSO₄ 濃度在5-20 mM之間調整。

4.根據權利要求1或2所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒，其特征在于：所述的一種具有“由多功能莖環結構維持的單側3’懸端雙螺旋結構”的探針的熒光基團與淬滅基團的修飾位置，熒光基團修飾在探針A鏈的5’端核苷酸上，淬滅基團修飾在5’端的互補位核苷酸或相鄰的核苷酸上。

5.根據權利要求1所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒，其特征在于：所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒用于對總RNA中的微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量檢測是通過如下步驟來實現的：

（1） 取濃度為10 μM的探針1 μL，加入到12 μL含DNA鏈置換酶2μL的雜交緩沖液中，混勻；

（2）向上述液體其中加入5 μL樣本，混勻后送realtimePCR儀檢測；

（3）檢測條件通常為60 ℃恒溫30分鐘，檢測溫度及檢測時間和可根據具體情況在50-65 ℃、5-30分鐘之間調整；

（4）結果分析，熒光強度累積速率與樣本中目的微小核糖核酸100（microRNA100）含量成正比，檢測結果判定的方法有兩種，當待測樣本中目的微小核糖核酸（microRNA100）含量較低時，相同時間內熒光強度值越高的樣本，其目的微小核糖核酸100（microRNA100）的含量越高；當待測樣本中目的微小核糖核酸100（microRNA100）含量較高時，達到相同熒光強度值所用時間越短的樣本，其微小核糖核酸100（microRNA100）的含量越高。

6.根據權利要求1所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒，其特征在于：所述的一種可直接對微小核糖核酸100（microRNA100）進行半定量的試劑盒利用這種空間結構的進行微小核糖核酸（microRNA100）的半定量檢測的工作原理是，靶序列啟動的自身信號循環放大反應”：初始結構的探針（無熒光信號）→靶序列的出現→與探針結合后引發探針變形（變形后發出熒光信號，非靶序列不引起探針變形）→鏈延伸→鏈置換（初始結構探針不會發生鏈延伸及鏈置換反應）→靶序列重新游離→再次引起其它初始形態的探針變形（自身信號循環放大）。