[發明專利]納米免疫磁珠及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710173694.2
• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN108287234A
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發明（設計）人: 柯長洪;劉華敏;李家玉
• 申請（專利權）人: 廣東順德工業設計研究院（廣東順德創新設計研究院）
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;張春耀

本發明公開了一種納米免疫磁珠及其制備方法和應用。本發明的納米免疫磁珠的制備方法可以制備50nm級別的葡聚糖包被Fe₃O₄和/或γFe₂O₃的納米免疫磁珠，得到的該納米免疫磁珠的粒徑小，并且粒徑分布均勻，穩定性好，可以避免磁珠聚集和沉降。此外，通過合成得到的納米免疫磁珠偶聯抗體，可以保證每批磁珠表面抗體的量基本一致，可重復性好，分選出來陽性細胞純度達到90％以上，雜質含量低，可廣泛應用在細胞的特異性分選和分離過程中。該納米免疫磁珠的制備方法快捷、簡便，成本較低，可廣泛推廣應用。

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，尤其是涉及一種納米免疫磁珠及其制備方法和應用。

背景技術

細胞分選在臨床診斷、細胞免疫治療等方面具有非常重要的作用。臨床診斷方面，例如：胎兒細胞分離以判斷胎兒是否有遺傳缺陷；癌細胞分離以實現癌癥的早期診斷和治療；造血干細胞移植，可作為惡性腫瘤大劑量放療、化療后造血支持治療的主要措施。細胞免疫治療方面，如從患者外周血單個核細胞中分離出免疫細胞，在體外采用細胞因子將其激活成為細胞因子誘導的殺傷性細胞，如DC-CIK細胞，或是采用基因工程技術給T細胞加入一個能識別腫瘤細胞并且同時激活T細胞的嵌合抗體使其在體外大量擴增后重新輸回體內，從而殺死具有相應特異性抗原的腫瘤細胞，如CAR-T細胞等。

細胞分選方法主要有兩大類：一類是基于細胞群之間存在沉降系數的差異而建立起來的密度梯度離心法(Density gradient centrifugation)；另一類是基于免疫識別特性的方法，包括熒光激活細胞分選方法(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)和磁性激活細胞分選法(亦稱為磁珠分選法，Magnetic-activated cell separation，MACS)。密度梯度離心法簡單易行，但分離得到的細胞純度低，且細胞表面的標志不明確，特異性較差，因此，目前己較少使用此種方法。流式細胞分選所得的細胞純度高、回收率高、不易被污染，但此方法所需的設備昂貴、耗時、對細胞刺激較大，且需要高水平的技術支持以及專業的操作人員。此外，該方法在一段時間內只能分選一個細胞樣品。

磁珠分選法是20世紀70年代發展起來的一種優異的細胞分選技術。其涉及的免疫磁珠是一種包被有單克隆抗體的磁性顆粒，可與靶細胞表面的抗原結合。在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的靶細胞被吸附而滯留在分選柱中，無該種表面抗原的細胞由于不能與磁珠連接而沒有磁性，不能在磁場中停留，從而達到細胞富集純化的目的。目前商品化的用于細胞分選的磁珠產品主要包括德國美天旎(Miltenyi)納米級葡聚糖包覆的超順磁性磁珠和美國戴諾(Dynal)微米級聚苯乙烯磁珠。而相對于戴諾微米級聚苯乙烯磁珠而言，美天旎的50nm左右的磁珠具有以下優勢：1、磁珠與細胞結合后，無需將磁珠解離下來，且對細胞生理和活性無任何影響；2、葡聚糖包裹的納米磁珠可降解、生物相容性好，對細胞無任何毒性；3、附著有小磁珠的靶細胞可進行流式分析而不受太大影響，對后續實驗無影響；4、分選出來的靶細胞純度高，可避免其他非特異細胞的干擾。

雖然美天旎的50nm磁珠性能較好，但是價格昂貴，國內的研究機構和企業基本依靠國外進口，這也讓中小企業望而卻步。雖然國內也陸續開發用于細胞分析、蛋白純化的磁珠，但是這些磁珠粒徑主要分布在微米級，而且包裹層主要集中在有機和無機物質，所得到磁珠的生物相容性和可降解性比較差，很難應用于生物體內。而有些包被的糖類物質是采用兩步法包裹，首先是采用共沉淀法合成納米裸磁珠，再在表面用葡聚糖進行包裹，這樣就會使得得到的納米粒子容易聚集，分散性比較差，如申請號為CN200710176211的專利申請中提到的方法；而采用一步法葡聚糖包裹的納米粒子，雖得到的穩定性較好，但是在基團修飾過程中用到溴化氰，然而溴化氰有劇毒也限制了其應用(如Clonis YD，Small DAP.High-performance dye-ligand Chromatograph.In Reactive in Protein and EnzymeTechnology(M).London:Macmillan Press，1987.87-100)。