[發(fā)明專利]一種評估造血干細胞移植植入狀態(tài)的多重實時定量方法所用試劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710172643.8
• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN107012209B
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許先國;何吉;洪小珍;章偉;朱發(fā)明
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省血液中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 梁寅春;劉曉春

一種評估造血干細胞移植植入狀態(tài)的多重實時定量方法所用試劑，由用于患者移植前和供者核苷酸多態(tài)性位點篩選的擴增673位點插入型、673位點缺失型、688位點插入型、688位點缺失型、803位點插入型、803位點缺失型、918位點插入型、918位點缺失型、944位點插入型、944位點缺失型、1066位點插入型、1066位點缺失型、1100位點插入型、1100位點缺失型、1151位點插入型、1151位點缺失型、1625位點插入型、1625位點缺失型、1989位點插入型、1989位點缺失型、2504位點插入型、2504位點缺失型、2568位點插入型、2568位點缺失型、2676位點插入型、2676位點缺失型等位基因的26對引物和用于熒光檢測的13條寡核苷酸探針組成。本發(fā)明對于提高造血干細胞移植成功率和術(shù)后生存率具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因定量檢測方法所用的試劑，尤其涉及一種用于評估造血干細胞移植植入狀態(tài)的多重實時定量方法所用的試劑。

背景技術(shù)

同種異基因造血干細胞移植(Hematopoiet ic stem cell transplantation,HSCT)，包括骨髓移植、臍血干細胞移植、外周血干細胞移植等，是治療惡性血液病(如白血病)和重癥非惡性血液病(如重癥再障貧血、重癥聯(lián)合免疫缺陷癥等)的重要手段。但是各種形式的移植都有疾病復(fù)發(fā)的可能。以白血病為例，即使是高強度的“清髓性”預(yù)處理，也很難完全清除患者自身白血病細胞克隆。在預(yù)處理中生存下來并逃脫移植物抗白血病效應(yīng)的惡性克隆是復(fù)發(fā)的主要原因，其總體復(fù)發(fā)率高達10％～30％，是導(dǎo)致移植失敗和影響患者術(shù)后長期存活的主要因素。所以，在HSCT術(shù)后對患者外周血或骨髓血樣本進行持續(xù)監(jiān)測，及早檢出患者自身細胞或動態(tài)性觀察供者和受者細胞嵌合比例的變化，對于判斷疾病復(fù)發(fā)和移植排斥，評估造血干細胞植入狀態(tài)，及時采取術(shù)后抗復(fù)發(fā)治療具有重要意義。此外，供受者細胞嵌合狀態(tài)的檢測對監(jiān)測實體器官移植術(shù)后移植物抗宿主病的發(fā)生、發(fā)展和療效也有重要作用。

移植術(shù)后細胞嵌合性檢測的方法，有微小殘留病流式細胞術(shù)、染色體核型檢測、熒光原位雜交、腫瘤標記基因分析等方法，但這些方法都不同程度地存在供受者識別特異性差、檢測靈敏度低、適用范圍不廣等缺陷。目前臨床上應(yīng)用最廣的嵌合性檢測方法是短串重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)檢測，作為在親子鑒定中廣泛應(yīng)用的STR技術(shù)，具有很好的供受者特異性識別能力。但作為一種定性而非定量PCR技術(shù)，STR技術(shù)對嵌合性分析的靈敏度僅為5％左右，不能在疾病復(fù)發(fā)早期準確評估移植植入狀態(tài)。近年來又發(fā)展了一種以核苷酸多態(tài)性實時熒光定量技術(shù)檢測細胞嵌合性的方法，分為單核苷酸多態(tài)性定量和插入/缺失多核苷酸多態(tài)性定量。前者因為供受者之間僅一個核苷酸的差異，故鑒別能力較低。而后者將多個核苷酸多態(tài)性的高鑒別能力與實時熒光定量的高準確性結(jié)合起來，能很好地對移植后供受者細胞嵌合狀態(tài)進行監(jiān)測。目前國外已發(fā)展了針對白種人群的多核苷酸多態(tài)性定量方法，但由于人種和遺傳學(xué)差異，這些核苷酸位點并不適用于中國人群，而且針對這些位點的引物、探針和方法受國外專利保護，并不公開。因此，設(shè)計制備一種適合中國人群遺傳特征的評估造血干細胞移植植入狀態(tài)的多重實時定量方法所用試劑，對于準確評估造血干細胞移植植入狀態(tài)，提高患者移植術(shù)后存活率具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于造血干細胞移植術(shù)后植入狀態(tài)評估的實時定量方法所用試劑，以克服上述現(xiàn)有STR等檢測技術(shù)的不足。

本發(fā)明的所述定量方法，在于提供在中國人群中具有高雜合度的13個插入/缺失多核苷酸多態(tài)性位點，設(shè)計每個位點的特異性引物和探針，并利用多核苷酸多態(tài)性位點的實時熒光定量，對造血干細胞移植術(shù)后樣本進行供受者細胞嵌合性檢測，以評估其植入狀態(tài)。具體包括以下步驟：

(1)制備患者移植前、移植后以及供者的基因組DNA；

(2)提供13個位點的26對篩選引物，用等位基因序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)，分別選擇性擴增步驟(1)得到的患者移植前和供者基因組DNA中的核苷酸序列；