[發明專利]一種去除TAQDNA聚合酶中核酸污染的方法

在審

• 申請號: 201710170705.1
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN107099518A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 蔣建林
• 申請（專利權）人: 蘇州斯奈普生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 上海申新律師事務所31272
• 代理人: 竺路玲

技術領域

本發明涉及生物化學技術領域，尤其涉及一種去除TAQ DNA聚合酶中核酸污染的方法。

背景技術

基于PCR的非常的敏感性，微量的核酸污染可能會導致不希望的假陽性結果。一些基于原核生物持家基因，如16S，的檢測方法，微量的核酸污染會造成非常大的問題，造成大量的假陽性結果，無法正確地檢測病原體。這種核酸污染可能來自PCR所用的水，dNTPs，引物，PCR緩沖液，PCR反應管和TAQ DNA聚合酶，前5種核酸污染可以用工程控制(engineering controls)避免或消除，TAQ DNA聚合酶中的核酸污染是主要的問題。通常需要除去或基本上消除來自TAQ DNA聚合酶中的DNA或RNA。這些診斷所用試劑蛋白酶絕大部分是用原核細胞表達純化的，有些產品沒有采取消除核酸污染方法，或沒有有效的完全消除污染的DNA的方法。目前市場上常用的多種公司DNA聚合酶，都或多或少含有細菌DNA污染。從RNA樣品除去DNA的常用方法是用I型脫氧核糖核酸酶(DNase)處理RNA樣品，然后通過加熱失活或結合樹脂的步驟除去DNase I，但該方法不能很好地消除TAQ DNA聚合酶中DNA。廣譜核酸酶Binuclease可將核酸水解為3-5bp的寡聚核苷酸，再經過色譜層析等方法消除污染的核酸，然而Binuclease是耐熱酶，微量的殘存的Binuclease會水解PCR系統中的引物和模板，降低PCR的敏感性甚至造成假陰性結果。

雖然在TAQ DNA聚合酶純化過程中采用了一定的消除核酸的方法和步驟，比如添加DNase和RNase消化DNA和RNA，但這并不能完全消化核酸，主要目的是減少蛋白樣本的粘稠度，以便于以后的蛋白純化步驟。初步純化TAQ DNA聚合酶后，可以用聚乙烯亞胺(PEI)沉淀，水/有機兩相體系沉淀法去除一部分大腸桿菌DNA，但也不能完全去除污染的核酸。多年來，已經發展了很多種進一步去除TAQ DNA聚合酶中污染的細菌DNA方法，例如物理射線處理，化學物質處理，物理射線結合化學物質處理，生物酶處理(核酸內切酶DNase I,核酸外切酶III以及限制內切酶)，及多種步驟及物質聯合處理。這些方法已經過單獨測試過，也有不一致的結果報道，此外，大多數凈化程序導致Taq聚合酶性能下降。有些方法，如核酸內切酶DNase I處理只能水解DNA，無法處理RNA。最重要的是，這些處理對于消除非常低分子量的DNA片段(短于200bp)效果不佳。

廣譜核酸酶Binuclease作用于所有形式的核酸，包括雙鏈DNA、DNA：RNA雜交分子、單鏈DNA、單鏈RNA等等，將之降解為小于等于4個核苷酸長的寡核苷酸鏈，再經過色譜層析等方法很容易消除污染的核酸。然而Binuclease是耐熱酶，微量的殘存的Binuclease會水解PCR系統中的引物和模板，降低PCR的敏感性甚至造成假陰性結果。

發明內容

本發明為解決現有技術中的上述問題提出的一種去除TAQ DNA聚合酶中核酸污染的方法，通過Binuclease水解TAQ DNA聚合酶中污染的核酸，并通過本發明的特定方法完全除去Binuclease，從而達到完全消除TAQ DNA聚合酶樣本污染的核酸。

為了實現上述技術目的，本發明所采取的技術措施為：

一種去除TAQ DNA聚合酶中核酸污染的方法，包括如下步驟：

TAQ DNA聚合酶與廣譜核酸酶Binuclease直接孵育處理，用鎳樹脂結合TAQ DNA聚合酶，洗滌鎳樹脂，去除廣譜核酸酶Binuclease及其水解產物。

同時，上述的方法還可以替換為：

TAQ DNA聚合酶先結合到鎳樹脂，再用適量的廣譜核酸酶Binuclease注入鎳樹脂，孵育處理，洗滌鎳樹脂，去除廣譜核酸酶Binuclease及其水解產物。

優選地，所述鎳樹脂使用其他的二價金屬(例如Ni，Co，Cu，Fe)瓊脂糖樹脂或磁珠替代。

優選地，本發明答方法還進一步包括固定初步生產的TAQ DNA聚合酶量，用不同梯度單位的廣譜核酸酶Binuclease直接孵育處理，確定最佳廣譜核酸酶Binuclease用量的步驟。

優選地，使用分子篩法去除廣譜核酸酶Binuclease及其水解產物。

優選地，使用離子交換法去除廣譜核酸酶Binuclease及其水解產物。