[發明專利]應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法

有效

• 申請號: 201710169790.X
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106916217B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 袁子國;呂琳;王亞培;黃萬意;張秀香;馮偉利;呂淑媚;鄭玉香;周雪;陳雅俊
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12Q1/6893;C12Q1/04;G01N30/89;G01N21/33
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

1.一種應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)小鼠腦蛋白的提取,所述小鼠為弓形蟲慢性感染小鼠；

(2)對步驟(1)所得的蛋白質樣品進行FASP酶解、肽段標記；

(3)對步驟(2)標記的蛋白質樣品進行HPLC分離肽段混合物及LC-MS質譜分析；

(4)對上步所得的質譜鑒定結果進行生物信息學分析、定量分析，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質；

步驟(3)具體包括：

a)第一維高pH-RP液相分離，所述第一維高pH-RP液相分離具體包括：

平衡柱子，然后將步驟(2)標記后的多肽用A相復溶，進樣后以0.2ml/min的速率進行梯度洗脫：B相從5％到37％，最后在5min內使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；

收取肽段溶液，真空干燥后，進行第二維LC-MS分析；

其中，A相為pH＝10的氨水，B相為含 80％乙腈的氨水, B相pH＝10；

所述的平衡柱子具體包括：用95％的A相5％B相平衡柱子，所述柱子為Phenomenexcolumns，型號為Gemini-NX 3u C18 110A，規格為150*2.00mm；

所述梯度洗脫的程序包括：

；

b)步驟a)所述的第二維LC-MS分析采用第二維反相液質聯用RPLC-MS，所述的第二維反相液質聯用RPLC-MS具體包括：

步驟a)真空干燥后的肽段用樣品溶解液溶解，充分振蕩渦旋、離心，上清轉移到上樣管中，進行質譜鑒定；

所述樣品溶解液為0.1％甲酸、5％乙腈的混合液；

所述的第二維反相液質聯用RPLC-MS采用的色譜柱信息：75um i.d.x 150mm,裝填Acclaim PepMap RSLC C18,2μm, nanoViper；流動相A：0.1％甲酸；流動相B：0.1％甲酸，80％硝酸鈰銨；流速：300nL/ min；每個組分分析時間：65min；有效梯度：B相從5％上升至35％，40min；

所述的第二維反相液質聯用RPLC-MS采用的梯度洗脫程序包括：

。

2.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，步驟(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一種或多種。

3.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質不低于4983個蛋白。

4.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，獲取的弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質中，上調蛋白有不低于215、159或48個。

5.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，獲取的弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質中，下調蛋白有不低于246、353或62個。

6.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，獲得的差異表達蛋白質涉及的通路包括氧化磷酸化信號通路、谷氨酸能突觸信號通路、鈣信號信號通路、cGMP-PKG信號通路、突觸囊泡循環信號通路，以及Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb蛋 白相關信號通路中的一種或多種。

7.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，獲得的差異表達蛋白質涉及的弓形蟲慢性感染關聯疾病包括亨廷氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥中的一種或多種。