[發明專利]一種基于轉錄組測序構建的棒狀桿菌組成型表達載體啟動子

有效

• 申請號: 201710169693.0
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN107164371B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 邢盼盼;蘇海霞;王炯;梅雪臣;萬坤;宋盟軍;李敬;劉愛福
• 申請（專利權）人: 武漢遠大弘元股份有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/77;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/15
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種基于轉錄組測序構建棒狀桿菌組成型表達載體啟動子的方法，本發明還公開了基于轉錄組測序構建的棒狀桿菌組成型表達載體啟動子、含有該啟動子的表達載體以及該表達載體轉化宿主細胞谷氨酸棒狀桿菌獲得的重組菌株。用本發明獲得的啟動子構建的表達載體，對數期目的基因蛋白表達量低，但穩定期目的蛋白表達量相對于對數期大幅度提高，且對宿主菌生長影響低，質粒傳代穩定性高，適合于對數期不需要表達，而穩定期需要高度表達的目的基因的載體構建，尤其適合于氨基酸發酵用工程菌株的構建。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及棒狀桿菌組成型表達載體啟動子及其構建方法，本發明還涉及含有所述該啟動子的表達載體及重組菌株。

背景技術

棒狀桿菌是一類革蘭氏陽性菌，棒狀桿菌的三個主要代表：谷氨酸棒狀桿菌，黃色短桿菌和乳糖發酵短桿菌，已經被廣泛用于生產氨基酸和核苷酸等多種化學物質(Liebl等，1991)。經過物理或化學方法誘變處理得到的棒狀桿菌突變株具有較強的合成目的有用物質的能力，而通過遺傳工程和代謝工程對棒狀桿菌野生菌株或突變株進行改造，可以獲得具有更高生產強度的菌株。代謝工程改造即是在棒桿菌的多種代謝途徑中尋找關鍵的代謝酶，通過基因工程改造調控關鍵代謝酶的基因表達。通常基因都是在啟動子的控制下表達，其表達強度依賴于啟動子元件。來自大腸桿菌、鏈霉菌和枯草芽孢桿菌的啟動子能夠在棒狀桿菌屬細菌中表達，可應用于棒狀桿菌的載體系統構建，如應用來源于大腸桿菌的Ptac、Ptrc啟動子構建的表達質粒PXMJ19，PEC-XK99E，基因在lacI^q的控制下進行誘導表達，但表達量低，且在生產過程中需要添加誘導劑IPTG，而IPTG相當昂貴，不適于用做大規模生產目的產品的基因表達誘導劑；乳糖能夠用來替代IPTG作為誘導物應用于大規模的生產，而對于絕大多數的棒狀桿菌菌株而言，乳糖都不能進入其細胞中(Brabetz等,1991)，這也限制了誘導型表達系統在棒狀桿菌中的應用。

組成型啟動子不需誘導等特殊條件即可在菌體存活期持續不斷地表達外源基因，從而簡化了操作過程、且具有相對較高的安全性，因此更適合在實際生產中應用。在不同細菌的管家基因中應用PCR擴增DNA探針等手段篩選并純化具有強表達性的組成型基因，篩選出組成型的強啟動子，用于重組載體的構建(Jensen P R et al.,Appl EnvironMicrobiol,1998,64(1):82-87.)。楊柳等利用谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的內源強啟動子Pgro有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中的表達(楊柳等，新能源進展，2014,5(2):353-357)，王小元等通過突變得到轉錄啟動功能的tac-M啟動子，構建組成型表達載體PDXW-10，在棒狀桿菌中，該載體表達外源蛋白的水平適中(CN：200910210962.9)。組成型啟動子表達雖然具有很多優點，但目前篩選方法復雜，且如何選擇合適的啟動子進行調控，以避免因為過量的蛋白表達而導致宿主菌生長停滯或代謝障礙，或使宿主能量耗竭以及質粒丟失是工業化生產亟待解決的問題。目前存在使用如Pgro作為啟動子，與目的基因一起構建組成表達型質粒，這類質粒在細菌對數生長期也進行目的基因的表達，導致質粒在穩定期之前丟失嚴重，從而降低了表達效果。

本發明的目的就是建立一種方法，尋找細菌對數生長期沉默，細菌生長停滯期高效表達的啟動基因，用它來構建組成型高效表達質粒。在本發明中，我們應用轉錄組測序的分析數據，尋找一類能調控目的基因在對數期表達弱，而穩定期大量表達的啟動子，一般這類啟動子都是可調控型啟動子，我們截取這些啟動子不同的基因片段，構建了一系列棒狀桿菌組成型表達載體，該系列表達載體應用綠色熒光蛋白(EGFP)作為標記基因，探測各啟動子片段活性強弱，且考核各探測質粒傳代穩定性，從而篩選出一系列對數期啟動子活力低、穩定期啟動活力高的啟動子，并考核含各啟動子的質粒傳代穩定性，進一步篩選出使質粒穩定的啟動子。

發明內容