[發(fā)明專利]生產米爾貝霉素的重組鏈霉菌及其制備方法和應用

有效

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• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106754608B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設計）人: 黃雋;黨福軍;周軍;徐晴雨;李娜
• 申請（專利權）人: 浙江海正藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C07K14/36;C12P17/18;C12R1/465;C12R1/55
• 代理公司: 北京永新同創(chuàng)知識產權代理有限公司 11376
• 代理人: 欒星明;程大軍

本發(fā)明涉及一種生產米爾貝霉素的重組鏈霉菌，相對于相應的野生型鏈霉菌或者產生該重組鏈霉菌的起始鏈霉菌，所述重組鏈霉菌選自如下的至少一個基因是失活的：編碼SEQ ID NO：8或與其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2、編碼SEQ ID NO：9或與其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3、編碼SEQ ID NO：10或與其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4和編碼SEQ ID NO：11或與其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。本發(fā)明還涉及產生所述重組鏈霉菌的方法和使用所述重組鏈霉菌生產米爾貝霉素的方法。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及制備生產抗生素、特別是米爾貝霉素的重組工程化鏈霉菌的方法和獲得的重組鏈霉菌及其應用。

發(fā)明背景

米爾貝霉素是一種大環(huán)內酯類驅蟲藥物，日本三共株式會社于1967年發(fā)現，經過多年改良于1986年正式以商品名米爾貝肟(milbemycin oxime)上市。米爾貝肟是米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4的肟衍生物，米爾貝肟對控制和預防大部分常見寄生蟲疾病都有很好的效果。通常用來預防惡絲蟲病，控制線蟲、鉤蟲引發(fā)的犬、貓疾病及犬的鞭蟲病。由于米爾貝肟殺蟲活性高、毒性小，LD50是臨床推薦用量的2000倍以上，同時對阿維菌素類藥物敏感的犬毒性較小，所以具有很好的市場前景。

目前能產米爾貝霉素的菌株有米爾貝霉素鏈霉菌(Streptomycesmilbemycinicus)、冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)例如吸水鏈霉菌金淚亞種(Streptomyces hygroscopicussubsp.aureolacrimosus)和灰產色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)。它們除主要產生有效組分米爾貝霉素A3/A4外，還可產生近三十多種米爾貝霉素類似物，其中常見的有C5-O-甲基米爾貝霉素B2、B3、β1、β2、α9和α10(US4144352)。這些類似物的產生不僅會降低米爾貝霉素A3/A4的產量，而且會嚴重影響米爾貝霉素A3/A4后期的分離純化。

向文勝等報道通過基因工程改造獲得了去除米爾貝霉素B2、B3、β1和β2以及南昌霉素的重組冰城鏈霉菌(CN 103468625 B)。但是還有一類米爾貝霉素類似物α9和α10(圖1)在米爾貝霉素提取純化過程中很難徹底去除(Takiguchi Y et al.1980,Milbemycins,anew family of macrolide antibiotics:fermentation,isolation and physico-chemical properties.J Antibiot(Tokyo).1980Oct；33(10):1120-7)。目前本領域尚未鑒別鏈霉菌中關于米爾貝霉素類似物α9和α10的合成途徑，因此沒有關于通過改造相關途徑而降低或去除米爾貝霉素類似物α9和α10的相關報道。本領域需要能夠在生產米爾貝霉素例如米爾貝霉素A3/A4的同時減少或阻斷雜質組分例如米爾貝霉素類似物α9和α10的方法和手段。

發(fā)明內容

本發(fā)明人意外地發(fā)現失活鏈霉菌中的本發(fā)明所述基因mpca2、mpca3、mpca4和mpca5中的至少一個時，使用該鏈霉菌生產米爾貝霉素時能夠去除雜質組分米爾貝霉素類似物α9和α10，而不影響或者有利于米爾貝霉素的生產，簡化米爾貝霉素提取純化工藝，降低生產成本。在某些情況中，使用本發(fā)明的重組鏈霉菌生產米爾貝霉素時不但能夠去除雜質組分米爾貝霉素類似物α9和α10，還能夠提高有效組分米爾貝霉素A3/A4的發(fā)酵單位。

本發(fā)明提供了一種重組鏈霉菌，使用該重組鏈霉菌生產米爾貝霉素時，相對于使用相應的野生型或起始鏈霉菌生產米爾貝霉素時，降低或完全去除米爾貝霉素類似物α9和α10雜質組分含量。