[發(fā)明專利]一種棒狀桿菌組成型表達(dá)載體啟動(dòng)子、含有該啟動(dòng)子及l(fā)rp基因的表達(dá)載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710169454.5
• 申請(qǐng)日: 2017-03-21
• 公開（公告）號(hào): CN107164369B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢盼盼;蘇海霞;王炯;梅雪臣;萬坤;宋盟軍;李敬;劉愛福
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢遠(yuǎn)大弘元股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/77;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/15
• 代理公司: 武漢開元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了一種基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序構(gòu)建棒狀桿菌組成型表達(dá)載體啟動(dòng)子的方法，本發(fā)明還公開了基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序構(gòu)建的棒狀桿菌組成型表達(dá)載體啟動(dòng)子、含有該啟動(dòng)子的表達(dá)載體以及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞谷氨酸棒狀桿菌獲得的重組菌株。用本發(fā)明獲得的啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體，對(duì)數(shù)期目的基因蛋白表達(dá)量低，但穩(wěn)定期目的蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)數(shù)期大幅度提高，且對(duì)宿主菌生長(zhǎng)影響低，質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性高，適合于對(duì)數(shù)期不需要表達(dá)，而穩(wěn)定期需要高度表達(dá)的目的基因的載體構(gòu)建，尤其適合于氨基酸發(fā)酵用工程菌株的構(gòu)建。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及棒狀桿菌組成型表達(dá)載體啟動(dòng)子及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還涉及含有所述該啟動(dòng)子的表達(dá)載體及重組菌株。

背景技術(shù)

棒狀桿菌是一類革蘭氏陽性菌，棒狀桿菌的三個(gè)主要代表：谷氨酸棒狀桿菌，黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌，已經(jīng)被廣泛用于生產(chǎn)氨基酸和核苷酸等多種化學(xué)物質(zhì)(Liebl等，1991)。經(jīng)過物理或化學(xué)方法誘變處理得到的棒狀桿菌突變株具有較強(qiáng)的合成目的有用物質(zhì)的能力，而通過遺傳工程和代謝工程對(duì)棒狀桿菌野生菌株或突變株進(jìn)行改造，可以獲得具有更高生產(chǎn)強(qiáng)度的菌株。代謝工程改造即是在棒桿菌的多種代謝途徑中尋找關(guān)鍵的代謝酶，通過基因工程改造調(diào)控關(guān)鍵代謝酶的基因表達(dá)。通常基因都是在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度依賴于啟動(dòng)子元件。來自大腸桿菌、鏈霉菌和枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子能夠在棒狀桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)，可應(yīng)用于棒狀桿菌的載體系統(tǒng)構(gòu)建，如應(yīng)用來源于大腸桿菌的Ptac、Ptrc啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒PXMJ19，PEC-XK99E，基因在lacI^q的控制下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)量低，且在生產(chǎn)過程中需要添加誘導(dǎo)劑IPTG，而IPTG相當(dāng)昂貴，不適于用做大規(guī)模生產(chǎn)目的產(chǎn)品的基因表達(dá)誘導(dǎo)劑；乳糖能夠用來替代IPTG作為誘導(dǎo)物應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)，而對(duì)于絕大多數(shù)的棒狀桿菌菌株而言，乳糖都不能進(jìn)入其細(xì)胞中(Brabetz等,1991)，這也限制了誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)在棒狀桿菌中的應(yīng)用。

組成型啟動(dòng)子不需誘導(dǎo)等特殊條件即可在菌體存活期持續(xù)不斷地表達(dá)外源基因，從而簡(jiǎn)化了操作過程、且具有相對(duì)較高的安全性，因此更適合在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。在不同細(xì)菌的管家基因中應(yīng)用PCR擴(kuò)增DNA探針等手段篩選并純化具有強(qiáng)表達(dá)性的組成型基因，篩選出組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，用于重組載體的構(gòu)建(Jensen P R et al.,Appl EnvironMicrobiol,1998,64(1):82-87.)。楊柳等利用谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子Pgro有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中的表達(dá)(楊柳等，新能源進(jìn)展，2014,5(2):353-357)，王小元等通過突變得到轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)功能的tac-M啟動(dòng)子，構(gòu)建組成型表達(dá)載體PDXW-10，在棒狀桿菌中，該載體表達(dá)外源蛋白的水平適中(CN：200910210962.9)。組成型啟動(dòng)子表達(dá)雖然具有很多優(yōu)點(diǎn)，但目前篩選方法復(fù)雜，且如何選擇合適的啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控，以避免因?yàn)檫^量的蛋白表達(dá)而導(dǎo)致宿主菌生長(zhǎng)停滯或代謝障礙，或使宿主能量耗竭以及質(zhì)粒丟失是工業(yè)化生產(chǎn)亟待解決的問題。目前存在使用如Pgro作為啟動(dòng)子，與目的基因一起構(gòu)建組成表達(dá)型質(zhì)粒，這類質(zhì)粒在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期也進(jìn)行目的基因的表達(dá)，導(dǎo)致質(zhì)粒在穩(wěn)定期之前丟失嚴(yán)重，從而降低了表達(dá)效果。

本發(fā)明的目的就是建立一種方法，尋找細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期沉默，細(xì)菌生長(zhǎng)停滯期高效表達(dá)的啟動(dòng)基因，用它來構(gòu)建組成型高效表達(dá)質(zhì)粒。在本發(fā)明中，我們應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析數(shù)據(jù)，尋找一類能調(diào)控目的基因在對(duì)數(shù)期表達(dá)弱，而穩(wěn)定期大量表達(dá)的啟動(dòng)子，一般這類啟動(dòng)子都是可調(diào)控型啟動(dòng)子，我們截取這些啟動(dòng)子不同的基因片段，構(gòu)建了一系列棒狀桿菌組成型表達(dá)載體，該系列表達(dá)載體應(yīng)用綠色熒光蛋白(EGFP)作為標(biāo)記基因，探測(cè)各啟動(dòng)子片段活性強(qiáng)弱，且考核各探測(cè)質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性，從而篩選出一系列對(duì)數(shù)期啟動(dòng)子活力低、穩(wěn)定期啟動(dòng)活力高的啟動(dòng)子，并考核含各啟動(dòng)子的質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性，進(jìn)一步篩選出使質(zhì)粒穩(wěn)定的啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容