[發明專利]核酸的等位基因特異性擴增

在審

• 申請號: 201710169202.2
• 申請日: 2010-12-10
• 公開（公告）號: CN106987624A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: A.贊;N.牛頓;S.G.威爾
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 杜艷玲,魯煒

本申請是國際申請日為2010年12月10日、國際申請號為PCT/EP2010/007560、進入國家階段的申請號為201080055770.6、發明名稱為“核酸的等位基因特異性擴增”的PCT申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及核酸擴增領域，并且具體地涉及等位基因特異性擴增領域。

背景技術

核酸的等位基因特異性擴增允許靶序列的同時擴增和分析。當靶核酸在其序列中具有一個或多個變異（多態性）時，通常使用等位基因特異性擴增。核酸多態性用于DNA概況分析（法醫學、親權認定、用于器官移植的組織分型）、遺傳作圖、區分微生物的致病菌株以及罕見突變的檢測，例如在癌細胞中出現、在具有正常DNA的細胞背景中存在的那些。

在成功的等位基因特異性擴增中，擴增靶核酸的所需變體，同時不擴增其他變體，至少不擴增至可檢測水平。一般的等位基因特異性擴增測定涉及用這樣設計的至少一種等位基因特異性引物的聚合酶鏈反應（PCR），從而使得引物延伸僅在引物與靶序列的所需變體形成雜交體（hybrid）時發生。當引物與靶序列的不希望有的變體雜交時，引物延伸被抑制。

已提出了增強引物的等位基因特異性的許多方法。然而，對于缺乏PCR特異性的許多臨床相關的核酸靶仍是問題。因此，完全需要設計等位基因特異性引物的新方法。

發明內容

在第一個方面，本發明涉及靶序列變體的等位基因特異性擴增的方法，所述靶以幾個變體序列的形式存在，該方法包括

（a）使第一種和第二種寡核苷酸與靶序列的至少一個變體雜交；其中第一種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且第二種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸；

（b）用核酸聚合酶延伸第二種寡核苷酸，其中所述聚合酶能夠在所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時優先延伸所述第二種寡核苷酸，并且在所述選擇性核苷酸不與靶形成堿基對時基本上更少。

在第二個方面，本發明涉及檢測靶序列變體的方法，所述靶以幾個變體序列的形式存在，該方法包括

（a）使第一種和第二種寡核苷酸與靶序列的至少一個變體雜交；其中所述第一種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且所述第二種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸；

（b）用核酸聚合酶延伸第二種寡核苷酸；其中所述聚合酶能夠在所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時優先延伸所述第二種寡核苷酸，并且在所述選擇性核苷酸不與靶形成堿基對時基本上更少；和

（c）檢測所述寡核苷酸延伸的產物，其中延伸表示寡核苷酸對其具有互補選擇性核苷酸的靶序列變體的存在。

在第三個方面，本發明涉及用于靶序列的等位基因特異性擴增的試劑盒，所述靶以幾個變體序列的形式存在，該試劑盒包括

（a）與靶序列的一個或多個變體至少部分互補的第一種寡核苷酸；和

（b）具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸、與靶序列的一個或多個變體至少部分互補的第二種寡核苷酸。

在第四個方面，本發明涉及用于執行靶序列的等位基因特異性擴增的寡核苷酸，所述靶以幾個變體序列的形式存在，該寡核苷酸包括

（a）與所述靶序列的一個或多個變體的部分至少部分互補的序列；

（b）與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸。

在第五個方面，本發明涉及用于靶序列的等位基因特異性擴增的反應混合物，所述靶以幾個變體序列的形式存在，該混合物包括

（a）與靶序列的一個或多個變體至少部分互補的第一種寡核苷酸；和

（b）與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，但具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸的第二種寡核苷酸。

附圖說明

圖1顯示了根據本發明使用各種核酸聚合酶和具有內部選擇性核苷酸的引物的等位基因特異性擴增結果。

圖2顯示了使用各種核酸聚合酶和具有3’選擇性核苷酸作為對照的各種引物的等位基因特異性擴增結果。

圖3顯示了根據本發明使用各種核酸聚合酶和具有內部選擇性核苷酸的各種引物的等位基因特異性擴增結果，包括具有蝎子ARMS形式的引物。

圖4顯示了可以根據本發明使用的蝎子ARMS形式的結構的示意圖示。

具體實施方式

定義